焦磷酸测序简介.PPT

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * . * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 引物设计 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 引物设计 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 PCR PCR引物（其中一条有生物素标记）必须HPLC纯化或相当； PCR必须高保真，建议PyroMark PCR Kit (200) (cat. no. 978703) ，扩增体系和条件见右图； 一般用5~20ul扩增物 (Q24 Adv) ； 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 程序设计——Assay 设计dNTP分配顺序： 点击工具栏 New Assay图标；文件夹右键New Assay；File New Assay; AQ Assay: 等位基因 SNP Assay:核苷酸多态性 CpG Assay：甲基化 SEQ Assay：未知序列测序 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 程序设计——Assay AQ/SNP Assay设计： Sequence to Analyze; Generate Dispensation Order; Dispensation Order SEQ Assay 设计： 直接在Dispensation Order 输入 CpG Assay设计： Sequence Before Bisulfite Treatment Sequence to Analyze Forward/Reverse Orientation Generate Dispensation Order C 或G 作为转化的control CpN 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 程序设计—— New Run 板孔分别用哪个Assay： File New Run （或右键） Run Name: 选择Assay： 拖动与“Ctrl+拖动”，选择 填写Sample ID： 拖动与“Ctrl+拖动” 填写Note： Instrument Method: 按Cartridge 选择 Save 文件copy 到专用U盘中 ToolPre Run information 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 样品准备及上机运行 目的：制备单链DNA模板并结合测序引物，为测序作准备 1.PCR产物固定 2.制备单链DNA模板 3.测序引物与模板结合 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 所有试剂应恢复到室温； 珠子吸取前要充分混匀并避免产生气泡； 珠子的优化，建议用1ul； 可先做一个Mix， 每次分装Mix应充分混合； PCR管要干净； PCR产物一般用10~20μl/孔； 要用超纯水将终体积调到80 μl/孔； 盖紧PCR管盖； 体系在被吸取前1min之内必须还在振摇。 室温1400RPM振摇5~10min 1.PCR产物固定 1ul/sample 样品准备及上机运行 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 在固定震荡时 作上机准备 检查Cartridge工作是否正常 PyroMark Q24 Adv Cartridge (# 979202 ) 无粉手套，超纯水； 挤压，水柱垂直不偏 自然凉干 30次更换 样品准备及上机运行 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析 Instrument Method 按试剂舱号码选 Plate Setup 选中孔位和assay Tool Pre Run Information 按提示加E、S和dNTP（位置和用量） E 、S分别超纯水复溶； dNTP不能冻结保存！ 样品准备及上机运行 引物设计 PCR Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 程序设计 样品准备 上机运行 结果分析