微生物学通报巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中诱导表达及碳.PDF

微生物学通报 Dec. 20, 2018, 45(12): 2552−2562 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.171059 研究报告 巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中 诱导表达及碳代谢去阻遏 郭瑞1,2 李由然1,2 王均华1,2 石贵阳1,2* (1. 214122) (2. 214122) 摘 要：【背景】β-淀粉酶在食品和医疗领域应用广泛。目前工业上使用的 β-淀粉酶主要从植 物中提取，生产成本高，限制了β-淀粉酶的应用。微生物生产的β-淀粉酶尽管早有报道，但由 于产酶水平低下，因而一直未能实现工业化。【目的】实现巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢 杆菌中的高效诱导表达，缓解碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression ，CCR)对该重组酶 表达的影响，并研究其酶学性质。【方法】克隆枯草芽孢杆菌木糖诱导启动子，构建木糖诱导 表达载体以介导巨大芽孢杆菌1514 的β-淀粉酶编码基因amyM 在枯草芽孢杆菌中的异源表达。 定点突变位于amyM 信号肽编码区的分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element ，CRE) ， 降低碳源代谢对重组β-淀粉酶施加的阻遏。【结果】构建了诱导表达β-淀粉酶基因的重组枯草 芽孢杆菌菌株。同义替换amyM-CRE 保守碱基在不同程度上缓解了碳源所施加的CCR 效应， 重组酶的表达水平得到显著提高。重组酶的分子量为57 kD ，水解可溶性淀粉主要生成麦芽糖 2+ 和少量葡萄糖，其中麦芽糖含量为72%。该酶最适作用温度为50 °C ，最适反应pH 为6.0。Co 、 Ca2+对重组 β-淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统和碳代谢去阻遏实现了 β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达，酶活最高可达97.16 U/mL 发酵液，比amyM 基因来 源菌巨大芽孢杆菌 1514 的β-淀粉酶产量提高了440 倍，为 β-淀粉酶发酵生产的工业化提供 了支撑。 关键词：枯草芽孢杆菌，木糖诱导启动子，β-淀粉酶，碳分解代谢物阻遏，分解代谢物响应元 件，酶学性质 Foundation items: National Natural Science Foundation of China ; Autonomous Program of Jiangnan University (JUSRP51503) *Corresponding author: Tel: 86-510 E-mail: gyshi@ Received: December 17, 2017; Accepted: March 13, 2018; Published online () : July 02, 2018 基金项目： (JUSRP51503) *通信作者：Tel 86-510E-mail gyshi@ 收稿日期：2017-12-17 接受日期：2018-03-13 网络首发日期() ：2018-07-02 : β- 2553 Inducible heterologous expression and carbon catabolite repression