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重组DNA技术概述 重组DNA技术产生的基础 1 DNA分子的切割与连接技术 1970年Smith HinfI 1972年Herbert EcoRI 1970年Khoranan T4DNA连接酶 1972年第一次体外重组DNA SV40与λDNA 2 载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 1970年Mandel发现适当浓度的CaCl2处理大肠杆菌，可使其转化效率大大提高。 1973年构建出人造质粒，并能够转化和在宿主菌中复制。 3 Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应 1975 Southern发明Southern blot（印迹） 1977 Sanger 双脱氧终止法DNA测序技术。 1985 Millus PCR 遗传密码表 东方神秘主义----易经的核心是阴阳 阴的符号为－－，阳的符号为－。阴阳的相互交融，便构成了宇宙中无穷层次的阴阳体。 “无极生太极，太极生两仪，两仪生四象，四象生八卦” 易经中的阴阳衍生规律，反映了宇宙中物质从简单到复杂的派生规律。 《易传·系辞》曰：“一阴一阳之谓道。”易经中的64卦，每一行称为宫。64卦从下往上数，第1、3、5、7宫称为阳宫，第2、4、6、8宫称为阴宫。 这样排在阳宫上的遗传密码所译成的氨基酸，按照东方的思维就是阳性氨基酸，排在阴宫上的遗传密码所代表的氨基酸则是阴性氨基酸。 于是发现，西方的极性氨基酸与东方的阳性氨基酸基本一致。西方的非极性氨基酸与东方的阴性氨基酸基本一致。 重组DNA技术的定义及步骤 1 定义：Recombination DNA technology 是按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使期在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 克隆（clone）：无性繁殖系及其后代。基因完全相同。 基因克隆；基因工程等 2 重组DNA技术的基本步骤 （1）目的基因的获得 （2）目的基因与载体的连接 （3）重组DNA分子导入受体细胞 （4）筛选出含重组DNA的受体细胞 （5）克隆基因的表达以及表达产物的检测和分离纯化 3重组DNA技术的意义 填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 缩短了生物进化的时间 使人们能够对生物进行定向改造 重组DNA技术潜在的危机 为什么人们接受已被确认有危害的事物，却不接受其危害尚未确定的事物那？ 因为，人们有怀疑和惧怕新生事物的天性。 在人类的科学发展史上，没有一个重大的科技进展在开始阶段没被怀疑和否定的。 结论 任何一项科学技术的出现，若不加控制，任其滥用，肯定会给人类带来灾难，用于生产转基因食品的基因重组技术（基因工程）也不例外。 在整个社会的监督下、在政府的管理和协调下、在科学工作者的努力下，转基因食品给人类带来的利大大超过其带来的敝。 政府和相关科学工作者有责任客观地将转基因食品的真实情况告诉广大消费者，消费者有权知道在市场上，那种食品是转基因食品，那种不是转基因食品。 消费者有知情权和最终选择权。 重要的工具酶-----内切酶 1 限制性内切酶 定义：是一类能够识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。 命名：第1字母（大写）产生该酶细菌的属名的第一字母；第2、3字母（小写）细菌的种名；第4字母（大写）细菌菌株名；最后是罗马数字，代表该菌株中发现的第几个酶。 EcoRI，EcoRV BamHI，HinFI 2 功能 严格识别切割顺序，识别点多为回文结构，识别长度4-8bp，以6bp最常见。 切口2种 （1）平末端 5‘GGCC 3’ 5’GG CC 3’ 3‘CCGG 5’ 5’CC GG 5’ （2）粘末端 5‘GGATCC 3’ 5’G GATCC 3’ 3’CCTAGG 5’ 3’CCTAG G 5’ 异源同工酶（同裂酶）不同来源的内切酶，但有相同的识别位点，其切割位点可以一样或不同。 同尾酶：识别序列相关，切割后粘性末端相同。 远距离裂解酶：识别位点与切割位点不一致。 可变酶：识别位点中个别碱基可以变化，要求不特定。 SinI GG（A/T）CC CC（T/A）GG 3 DNA的甲基化作用 细菌体内存在限制和修饰系统（R-M） 对自身的DNA甲基化修饰，免受内切酶降解。 对外来的DNA通过限制性内切酶降解。 应用： 应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解 如：PstI和甲基化PstI的切割点相同，但切割的对象不同，结果不同。 4 内切酶的使用注意事项 用途 DNA重组克隆及亚克隆 DNA杂交与序列分析 改建质粒 构件基因组DNA物理图谱和文库 使用注意