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实验九 酪氨酸酶的动力学 【目的和要求】 【实验原理】 【实验方法】 【思考题】 * 1. 学会测定酶反应速度的基本方法。 2.掌握测定米氏常数Km值的原理和方法。 酪氨酸酶催化的反应为： ?475nm 常用单位时间内、产物的浓度增加量表示。 一、酶活力测定— 酶反应初速度的测定: Time Product Concentration v= dC /dt A =εC d ?: 3600 M-1cm-1 d: 1cm 确定酶反应时间！ 二、 底物浓度[S]对酶反应速度： 一级反应 混合级反应 零级反应 Effect of substrate concentration on the initial velocity of an enzyme-catalyzed reaction. ? Vmax Km Km值测定: 双倒数作图法 （一）酶反应初速度的测定：---酶反应时间的确定 在比色杯中，按下表依次加入试剂： 加入酶液后立即混匀，并每隔15秒读取475nm处的吸光值。 0.03 酪氨酸酶（mL） 1.97 磷酸缓冲液（mL） 1 L-多巴（mL） 注：酪氨酸酶 5U/?l 绘制产物浓度C-Time 反应曲线，观察酶反应初速度，确定酶反应时间。一般在30~120秒左右。 255 120 240 105 225 90 210 75 195 60 180 45 165 30 150 15 135 0 A 时刻（秒） A 时刻（秒） 各时刻的吸光值记录在下表： （二）米式常数的测定： 在比色杯中，采用已确定的酶反应时间X，分别记录各管反应开始时A0和X秒钟后的A1。 0.03 2.37 0.6 5 0.03 2.47 0.5 4 0.03 2.57 0.4 3 0.03 2.67 0.3 2 0.03 2.77 0.2 1 酪氨酸酶（ml） 磷酸缓冲液 （ml） 15mM L－多巴 (ml) 管号 每管反应体系仍为3ml。 记录数据于下表： 利用双倒数作图法，横坐标为1/S，纵坐标为1/v，分别求出Vmax和Km。 5 4 3 2 1 V（mM/min） ΔA（A1- A0） A1 A0 L－多巴浓度 （mM） 管号 1.?为什么酶活力测定的是酶反应初速度？如何确定酶反应时间？ 2. Km值的意义是什么？ *
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