关键词重组人粒细胞集落刺激因子;反相高效液相色谱法;高效体积排阻色谱法;分子量;纯度.docVIP

目的：测定重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的蛋白浓度、 分子量及纯度。方法：反相高效液相色谱(RP-HPLC)法及高效体积排阻 色谱法(SEC)。结果：蛋白浓度测定方法可靠，平均回收率为100.17%， RSD=0.8%。重现性好，日内RSD=0.7%，日间RSD=1.1%，且与福林-酚法(Lowry法)测得结果无显著差异。样品无需处理，可 直接上样，同时可得到样品的纯度数据。SEC法测得分子量与理论值相符合，且方法重现性 好，日内RSD为0.7%，日间RSD为1.9%，在测定分子量的 同时可得到rhG-CSF纯度数据。结论：适用于基因工程产品纯化各阶段 以及制剂蛋白浓度、分子量、纯度的测定。关键词　重组人粒细胞集落刺 激因子；反相高效液相色谱法；高效体积排阻色谱法；分子量；纯度 Analysis of recombinant human granulocyte colonystimulating factor by high-performance liquidchromatography Zhong Ying(Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Co .Ltd,Hangzhou 310018) ABSTRACT　OBJECTIVE：To de termine protein content,protein molecular weigh and purity of recombinant human granulocyte colony stimulating factor(rhG-CSF).METHOD:Reversed-pha se high-performance liquid chromatography(RP-HPLC) and high-performace size- exclusion chromatography(SEC) were used.RESULTS:The mean recovery is 100.17%,RSD=0.8%.The RSD of within-day and day-to day were less than 2.0%.The samples do not need to be pretreated.CONCLUSION:This method is suitable to analyze products of gene engineering.KEY WORDS　recombinant human granulocyte colony stimulating factor,R P-HPLC,SEC,molecular weigh,purity 　　重组人粒细胞集落刺激因子(rhG -CSF)是应用DNA重组技术生产的一种造血生长因子，它作用于骨髓中性粒细胞系造血前体 细胞，促进其增殖、分化，促进中性粒细胞的成熟和释放。临床上主要应用于肿瘤化疗引起 的中性粒细胞减少症，用于外周干细胞动员，与抗生素合用预防或治疗感染等。　　rhG-CSF 作为基因工程药物，在分离纯化过程中，蛋白质的定量测定对纯化的进行必不可少，同时在 产品的质量控制中，蛋白质浓度也是一个极重要的指标［1］。蛋白质浓度的测定有 多种方法，常用的方法有克氏定氮法、TCA比浊法、双缩脲法、福林-酚(Lowry)法、考马斯 亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法等等。但以上方法有种种局限性［2］，例如克氏 定氮法方法过于繁琐，双缩脲法不够灵敏，有近200种化合物影响Lowry法测定的结果,Bradf ord法在比色过程中易出现沉淀等等，因此以上方法均不适用于纯化过程中间体及成品中有 干扰物存在时rhG-CSF蛋白的定量分析。我们通过实验选择反相高效液相色谱法(RP-HPLC 法)作为测定有干扰因素存在时的蛋白定量，获得满意结果。　　同时rhG-CSF其分子量大小 以及纯度均是一个重要指标。蛋白质分子量大小的测定有多种方法，常用的有十二烷基硫酸 钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)法，聚丙烯酰胺梯度电泳，高效体积排阻色谱法(SEC 法)［3］,比较先进的方法有质谱法［4］。SDS法耗时长，且一块板上 最多同时可分析8个样品。质谱法需要昂贵的设备，不易普及。而高效体积排阻色谱法是根 据溶质分子大小而分离的一种液相色谱技术，大分子优于小分子被洗脱出来，根据已知分子 量的标准蛋白的洗脱体积可以建立测定蛋白质分子量的标准曲线，从标准曲线上计算出样品 分子量。方法简便、快捷，一次可分析多个样品。我们通过实验选择高效体积排阻色谱法测 定rhG-CSF分子量及纯度，获得满意结果。 1　材料和仪器 1.1　仪器　　Beckman公司高效液相色谱仪，包括125型泵，168型二极管阵列