目基因与克隆载体体外重组新.pptVIP

连接时考虑因素 实验步骤尽量简单易行 连接形成的节点序列应能被重新切割 对转录、转译中密码阅读不发生干扰 粘性末端连接 平末端连接 末端延伸连接： 末端转移酶（TDT）：在没有模板存在的条件下，能催化dNTP 随机加于DNA分子的3‘-OH端 人工接头：化学合成的两条互补寡核苷酸连，上面 带有一 至数个限制酶识别位点 作用：加至待克隆的平末端DNA片段两侧，酶切后 产生粘性末端 DNA衔接物：人工合成的双链寡核苷酸片段，一头为平末端 （与目的基因连接），另一头为特定酶的切后粘 性末端（与载体粘端连接） 基因工程的操作过程 切 接 转 增 检 连接方式 同聚物加尾 加人工接头 加DNA衔接物 粘性末端连接—单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶） 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA AATTC G 5 退火 G CTTAA AATTC G 5 G CTTAA 5 AATTC G T4-DNA ligase GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5 5 GAATTC CTTAAG 5 G CTTAA