冻融后2-细胞胚胎发育至囊胚建立人胚胎干细胞系.docVIP

冻融后2细胞胚胎发育至囊胚建立人胚胎干细胞系 杨华1 刘锋1 王钦1 邓志华1 邹彦1 史秋雯1 丘映1* 李东升2 基金项目：南宁市科学与技术开发计划项目（200801024C） 通讯作者：1丘映，女（1961- ）主任医师 教授 硕士生导师 主要从事人类生殖辅助技术Tel:0771-4824317,E-mail: HYPERLINK mailto:nnqying@ nnqying@ 2 李东升，男 （1960-）主任医师 教授 硕士生导师 主要从事人胚胎干细胞及分化的研究 Tel: 0719-8801418 Email: dsli1698@ 1 广西南宁市第二人民医院生殖医疗中心 2 湖北省太和医院、郧阳医学院胚胎干细胞重点实验室 摘要：目的：用解冻后废弃胚胎及部分患者捐献的冷冻胚胎建立胚胎干细胞系。方法：用程序解冻法解冻2001年-2007年来我生殖中心就诊的病人剩余冷冻胚胎，培养至囊胚，Pronase酶去除透明带后，全囊胚置于小鼠饲养层（MEF）中培养获得原代细胞，机械法结合Ⅳ型胶原酶消化法传代，并利用细胞形态观察、免疫荧光染色、核型分析、畸胎瘤切片胚层分析等方法对所建胚胎干细胞系进行鉴定。结果：序贯培养23枚废弃胚胎，有4枚培养到囊胚阶段；去除透明带后有2枚在MEF上贴壁生长，但只有一株成功扩增稳定传代至第80代；细胞集落呈典型的鸟巢状，有稳定的46XY核型；表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81抗原，RT-PCR检测有Nanog,Oct-4,Sox2等基因表达；同时在体外能分化为内、中、外三个胚层。结论：解冻后2-3细胞Ⅲ-Ⅳ级的废弃胚胎仍具有发育形成囊胚的潜能，并利用所得囊胚采用酶去透明带全胚培养法能建立稳定增殖的hES细胞系，为研究人胚胎干细胞及相关疾病的防治提供细胞模型和细胞来源。 关键词：人胚胎干细胞系 废弃胚胎 2细胞 引言 人胚胎干细胞（human embryonic stem cell,hESC）是从早期的胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离培养成的全能性干细胞，其在体外培养过程中可以维持干细胞的未分化状态，正常的二倍体核型及无限的增值能力，具有体内外分化能力和种系的嵌合能力[1]。目前，大部分全能性hESC系都是从5-8天的剩余囊胚的ICM中分离而来。只有很少部分是从评分低的囊胚或桑葚胚中分离而来。 目前，大部分研究已经证实了从小于10细胞的早期卵裂胚胎中获得hESC系[2,3,4]。以前报道大部分被认为发育停止的体外受精卵，只有一小部分的可以发育到桑葚胚或囊胚阶段[5,6,7]。最近有研究表明，发育迟缓的胚胎也可能成为hES的另一来源，建系率为0.8%，甚至，发育阻滞的胚胎仍表达全能性基因，在饲养层或细胞外基质上能原代细胞[2]。 利用本中心体外受精-胚胎移植胚胎冻融后只有2个细胞复活的胚胎以及病人怀孕后捐赠的冷冻胚胎为来源，序贯培养至囊胚阶段，从这些来源的囊胚中我们成功的分离出一株hESC系—NS1。 1. 材料方法 1.1 胚胎来源 2001年-2007年来我生殖中心行FET周期胚胎冻融后复苏率＜50%（复苏率=冻融后复苏细胞数/冻前细胞数）的体外废弃胚胎，以及解冻病人怀孕后捐赠的冷冻胚胎，经患者签署用于科学研究的相关知情同意书后，序贯培养至囊胚阶段。解冻试剂为Quinn’s　Advantige Thawing Media Kit，参照解冻试剂盒说明解冻，复苏胚胎置于Quinn’s　Advantige　Blastcysts　Medium(美国SAGE In-vitro Fertilization公司)液中培养。胚胎解冻复苏、囊胚培养及hESC培养情况见表1。 1.2 MEF 饲养层的制备 无菌取出妊娠12.5日龄的ICR小鼠（北京维通利华购买）胎鼠，去除头和内脏，残余部分用PBS冲洗干净。0.25%胰酶+0.02%EDTA 4℃消化过夜，次日加入等体积的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养液终止，制成细胞悬液，以1×105/ml的密度接种于含MEF培养液的T75培养瓶（美国Corning公司）中。MEF培养液以高糖DMEM培养基（Germany）为基础液,添加10%胎牛血清（Hyclon）、0.1mmol/Lβ巯基乙醇(GIBCO)、1%NEAA(vitrolife)、 以及100IU庆大霉素。接种细胞置于37℃、6%CO2饱和湿度环境培养，隔天换液，4-5天待细胞铺满瓶底用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化收集细胞原代冻存。部分细胞传至3-4代用1mg/ml丝裂霉素C处理2.5小时后，按1×106/ml接种到预先用0.1%明胶处理过的35mm培养皿（美国BD）中,置于培养箱中备用。 1.3 ICM的分离及hES