基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立-微生物学报.PDF

微生物学通报 Sep. 20, 2013, 40(9): 1723−1732 Microbiology China © 2013 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ 生物实验室 基于EMA-qPCR 的茄科青枯菌活体 检测技术的建立 熊书 殷幼平 王芳 王中康* (重庆大学 生命科学学院 重庆市杀虫真菌生物农药工程技术中心 重庆市基因功能与调控重点实验室 重庆 400030) 摘 要: 【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与 实时荧光定量 PCR 技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方 法】样品 DNA 制备前经 EMA 渗透预处理, 再进行实时荧光定量 PCR 特异扩增菌体 DNA 。【结果】终浓度为2.0 mg/L 的EMA 能有效排除1.0×107 CFU/mL 灭活青枯菌细胞 DNA 的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的DNA 扩 增均没有影响。当每个定量PCR 反应体系中的活细胞在 5.0×100−5.0×104 CFU 范围内时, 扩增 C 2 t 值与定量PCR 反应体系中活细胞CFU 对数值呈良好的负相关性(R =0.992 5) 。比 较 EMA-qPCR 法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样 品可在24 °C 与4 °C 冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR 方法能有 效检测青枯菌VBNC 细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌PCR 检测的假阳性和假 阴性。 关键词: 茄科青枯菌, 叠氮溴乙锭, 活的非可培养状态, 活体检测, 实时荧光定量PCR 基金项目：国家自然科学基金项目(No. ; 国家公益性行业(农业)科研专项项目(No. 201003067); 中央高 校基本科研业务费资助项目(No. CDJXS112300) *通讯作者：Tel/Fax: 86-23 : zkwang646@ 收稿日期：2012-11-07; 接受日期：2013-01-25 1724 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.9 Establishment of a new method to detect viable cells of Ralstonia solanacearum by EMA-qPCR * XIONG Shu YIN You-Ping WANG Fang WANG Zhong-Kang (College of Life Science, Chongqing University, Chongqing Engineering Research Center for