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上转换荧光的应用 组员：徐翔丽 周贝 LOGO Upconversion Luminescence 比较各种荧光成像技术的特性 单光子激发发光、双光子激发发光及上转换发光的成像形式比较 基于上转换发光的活体成像技术 上转换发光纳米材料在肿瘤靶向成像中的应用 Upconversion Luminescence 荧光成像具有价格低廉、成像快速的特点，并具有 分子水平的敏感性(单分子成像)。其中，荧光探针在荧光成像中起到对观察对象进行标记和示踪的作用。 有机荧光团广泛用于荧光探针——其光稳定性差，不适合长时间观察，且其吸收和发射带较宽，Stokes位移较小，在多色成像时易串色。 半导体量子点具有光稳定性好且发射峰窄的特点，在生物医学研究中备受重视。但是，半导体量子点的潜在生物毒性和化学不稳定性限制了它在生物成像领域的进一步应用。 荧光染料和量子点通常是用高能量紫外(ultraviolet，UV) 或者可见光作为激发光，带来了一些明显的缺点，如较低的光穿透深度、可能的生物组织破坏，以及生物样品的自发荧光等。 Upconversion Luminescence 上转换发光(upconversion luminescence，UCL) 是指稀土离子吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子的发光现象，通常是指近红外(near infrared，NIR) 光转换为可见光。迄今为止，上转换材料主要是掺杂稀土元素的固体化合物，利用稀土元素的亚稳态能级特性，可以吸收多个低能量的长波辐射，从而使人眼看不见的红外光变成可见光。 相比有机荧光染料和量子点等下转换发光标记而言，上转换发光标记因采用近红外连续激光作为激发源，具有较深的光穿透深度、无生物背景荧光干扰、对生物组织几乎无损伤等显著优势。 Upconversion Luminescence 我们对UCNPs的上转换发光的成像形式（C）、有机染料(以罗丹明B为例) 的单光子（A）及双光子（B）激发发光的成像形式进行了比较。 在罗丹明B的单光子激发中，除了焦点处的染料分子产生荧光，焦平面上下的染料分子也被激发产生荧光。非焦面的荧光会严重地影响焦面处的图像，为了消除非焦面发光的影响，共聚焦荧光显微镜采用了针孔技术。在罗丹明B的双光子激发中，由于激发功率和发射强度存在平方关系，只有激光束聚焦的焦点处的染料分子被有效激发而发光；因此，双光子荧光成像具有内在的三维分辨率，不需要使用针孔技术。对UCNPs的上转换发光而言，沿着激发光的路径都有上转换发光。此外，稀土离子的摩尔吸光系数很低，对激发光的能量改变很小，因此上转换发光在焦平面上方和下方呈对称的圆锥形分布。 Upconversion Luminescence 焦点处的光子密度最大，随着与焦点的距离增大，光子密度迅速下降 多光子的吸收和能量转移是通过一系列实际存在的中间能级实现的，表现为激发功率和UCNPs的上转换发光强度之间存在非线性关系。以上实验结果说明：UCNPs的上转换发光的成像形式明显不同于有机染料的单光子及双光子激发发光的成像形式。非焦面的上转换发光信号对 UCNPs用于生物成像非常不利。 Upconversion Luminescence 2009年，我们发展了激光扫描上转换发光显微成像 (laser scanning up-conversion luminescence microscopy, LSUCLM) 技术，图 3 给出了激光扫描上转换发光显微镜的光路图。激光器发出的 980 nm 连续激光，首先通过整合扫描镜，然后被物镜聚焦到样品上；从扫描点上产生的发射光被整合扫描镜反射，然后通过一个反式的激发二色分镜 (短通)，以滤掉 980 nm 激发光；发射光随后通过共聚焦针孔和一个选择收集波长范围的狭缝光栅或带通滤光片，最后进入光电倍增管而被检测。其中，引入共聚焦针孔技术可以有效地消除非焦面的上转换发光的干扰，同时避免了焦面内散射光的影响，从而高分辨率。由于共聚焦针孔技术具有“光学切片”能力，用 LSUCLM 可以对上转换发光图像进行三维重建，实现三维上转换发光成像。 Upconversion Luminescence 用 DiI (红色) 和低浓度的 UCNPs (绿色) 对活细胞进行标记 (图 3)。值得注意的是，尽管 UCNPs 的上转换发光信号的收集范围 (500～600 nm) 已经覆盖了 DiI 信号采集范围 (560～600 nm)，单细胞的上转换发光图像上仍然没有来自 DiI 和自发荧光的信号。这归功于传统发光材料对980 nm 光的单光子吸收很弱，且传统发光材料在连续光激发下同时吸收两个光子的几率很低。因此，以 UCNPs 为探针的 LSUCLM 成像方法，能够完全消除来自内源性荧光物质和同时标记的荧光染料的背景干