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第四节 基因工程操作过程 转基因技术 一 DNA的体外重组（切、接） 二 DNA分子的转化和扩增（转、增） 转化的原理与技术 转化率 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。 三 转化子的筛选和鉴定（检） 遗传学方法 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 α-互补 蓝白斑筛选 免疫学方法 分子杂交 原位杂交 PCR 限制性酶切图谱 作业： 简述基因工程基本原理。 简述基因克隆的主要方法。 * * 一、DNA的体外重组（切、接） 二、重组DNA分子的转化和扩增（转、增） 三、转化子的筛选和鉴定（检） 粘性末端连接和5‘端去磷酸化 利用衔接物进行平末端的连接 3’5’粘末端平端化的连接 同聚物接尾法 转化的原理与技术 转化率 转化细胞的扩增 ■ Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。 基因工程菌 HB101,JM109 转化(transformation) 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态 感染(infaction) 转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程 转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热激） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 转化率的影响因素： 载体及DNA重组分子 受体细胞 转化方法 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作 转化细胞的扩增 扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 抗药性筛选法 显色筛选法 将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之插入失活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄（白）色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落 lacZ ori Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-） Ap pUC18 菌落噬菌斑原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。