小鼠胚胎干细胞分化扩增期连续低密度传代对原始细胞中Oct-4阳性细胞比例及神经分化能力的影响.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（４）：３９～４５ 小鼠胚胎干细胞分化扩增期连续低密度传代对原始 细胞中Ｏｃｔ４阳性细胞比例及神经分化能力的影响 １，２ １，２ １，２ １，２ １，２ １，２ １，２ 王　芳 　杜庆安 　朱宛宛 　吴　迪 　徐艳玲 　关云谦 　张　愚 （１首都医科大学宣武医院老年病研究所细胞生物学研究室　北京　１０００５３　２　教育部神经变性病重点实验室　北京　１０００５３） 摘要　目的：探讨在分化扩增期采用连续低密度传代的方法是否能降低小鼠胚胎干细胞向神经 细胞分化的前体细胞中Ｏｃｔ４阳性细胞的比例，以及对神经分化能力的影响。方法：采用“五步 法”将小鼠胚胎干细胞向神经元分化，进入扩增期后采用连续低密度传代的方法连续传 １０代。 然后应用细胞免疫组化鉴定Ｏｃｔ４阳性细胞、神经元与胶质细胞、流式细胞仪检测Ｏｃｔ４阳性细胞 比例、凋亡试剂盒测定细胞凋亡。结果：流式细胞仪检测出扩增期连续低密度传代得到的前体细 胞中Ｏｃｔ４阳性细胞的比例由１６．１７±４．８％降至４．３３±１．６３％，扩增期低密度传代细胞和正常高 密度传代细胞的细胞凋亡率鉴定分别为１５．１６±３．６４％ 和 １１．８８±２．６３％，步骤５诱导分化后的 细胞ＧＦＡＰ和Ｔｕｊ１免疫组化染色呈阴性。结论：低密度传代培养可以减少分化后 Ｏｃｔ４阳性细 胞的比例，且该比例下降不是由Ｏｃｔ４阳性细胞的凋亡引起的。同时可能是因为低密度传代培养 和高密度相比引起了细胞的质变、或者改变了前体细胞向神经元分化的某种微环境，导致了前体 细胞不能分化为神经细胞。提示高密度培养在前体细胞向神经元分化过程中具有重要作用，高 密度和低密度培养的比较，提供了研究ＥＳ细胞向神经元分化机制的新平台和研究方向。 关键词　胚胎干细胞　细胞培养　神经分化 中图分类号　Ｑ２５４ 　　干细胞及其分化细胞移植治疗可能是治疗很多疑 维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的作用，细胞生长速度突然变 难疾病的新希望，其中胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ， 快，数量会明显扩增，所以此期被称为“扩增期”或“增 ＥＳ）因为具有强的分化潜能，一直是研究的重点；特别 殖期”。判断细胞进入扩增期的标准很简单，“五步法” ［１，２］ 从步骤３进入步骤４要更换培养基，以此作为进入扩增 是治疗性克隆和ＩＰＳ技术的新进展 为产生和患者 基因型完全相同的ＥＳ细胞奠定了理论和技术基础，更 期的标准。扩增期是神经前体细胞向神经元分化的关 加推动了ＥＳ细胞研究的发展。 键时期，同时是大量提供前体细胞的时期。但在小鼠 　　而如何使ＥＳ细胞分化成为功能细胞一直是比较 ＥＳ细胞分化出的前体细胞移植治疗疾病的研究中遇到 困难的问题。小鼠ＥＳ细胞通过五步法分化是一个研 了致瘤性的困扰，关于致瘤性产生的原因还不完全清 ［３］ 楚，现在主要的观点认为是分化后残余的Ｏｃｔ４阳性的 究其向神经细胞分化的较好模型 ，其中步骤 ３为 ［４～６］ ＩＴＳＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ，ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｕｍ，ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）培 ＥＳ细胞导致了肿瘤形成 。 ５ ２ 养基培养，会有大量细胞在此步骤死亡，存活的细胞增 　　通常，扩增期细胞的接种密度为１．５×１０／ｃｍ，实 殖速度也非常缓慢。在步骤４，培养的细胞受碱性成纤 验中发现，扩增期细胞中的大部分倾向于聚集成团生 长，而其中表达 Ｏｃｔ４阳性的细胞比例维持在 １５％ ～ 收稿日期：