研究BMP-2对骨髓间充质干细胞促进造血干细胞增殖的影响.docVIP

研究BMP-2对骨髓间充质干细胞促进造血干细胞增殖的影响.doc

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四 川 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文 四 川 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文 研究BMP-2对骨髓间充质干细胞促进造血干细胞增殖的影响 李书坛 朱小凤 黄纯兰 通讯作者:黄纯兰 教授,联系方式:电 HYPERLINK mailto: 通讯作者:黄纯兰 教授,联系方式:电 HYPERLINK mailto:邮箱huangcll880@163.com 邮箱huangcll880@163.com 国家自然基金课助 [摘要] 目的:通过非接触共培养HSC与MSC,并用rhBMP-2干预,在第三天时检测HSC的增殖,可以探讨MSC和BMP-2对HSC增殖的影响以及BMP-2如何调节MSC对HSC增殖。方法:利用Transwell(小室微网孔径0.4um)非接触共培养经磁珠分选的骨髓HSC与全骨髓法体外扩增至P3代的MSCs,并用BMP-2干预。培养至72小时用计数板计数每组HSC的四个复孔的数目、TRIZOL法提取各组HSC的RNA后测定各组HSC的RNA的含量以及qRT-PCR法检测各组HSC的增殖基因Ki67的mRNA的表达。结果:1.全骨髓法成功培养出MSCs;磁珠分选法分选出了较高纯度的HSC。 2.三天后各组HSC增殖的情况:①细胞计数(×104个):HSC+MSC组(3.03±0.50)、HSC+BMP2组(1.70±0.51)均高于HSC组(1.2±0.43);HSC+MSC+BMP2组(5.29±0.20)高于HSC+MSC组(3.03±0.50)。②RNA量:HSC+BMP2组(138±3.464)及HSC+MSC组(163±3.559)高于HSC组(113±2.944);HSC+MSC+BMP2组(241±3.651)高于HSC+MSC组(163±3.559)。③荧光定量PCR法检测HSC的Ki67的mRNA相对表达量:HSC+MSC组(3.27±0.08)及HSC+BMP2组(2.44±0.26)高于HSC组(1.00±0.13);HSC+MSC+BMP2组(5.08±0.20)高于HSC+MSC(3.27±0.08);以上P值均<0.05。结论: BMP-2可以促进HSC增殖;MSC可以促进HSC增殖;BMP-2可以促进MSC对HSC的增殖作用。 关键词:造血干细胞;间充质干细胞;BMP-2;微龛;增殖; 生存在骨髓微环境即微龛(niche)中的造血干细胞(HSCs)为所有成熟血细胞的原始造血细胞,由于在骨髓中CD34抗原主要存在于幼稚造血干/祖细胞(HS/PC)、极少量骨髓基质细胞和内皮细胞的表面,故CD34抗原是造血干/祖细胞的重要标志,我们常用此抗原分选HSC。间充质干细胞(MSC)是微龛中的重要干细胞,体外培养具有贴壁性;表达CDl05、CD73、CD90等一些特定的表面抗原,不表达CD45、CD34、等造血标记;可以向成骨细胞、内皮细胞等各种细胞分化。微龛极其复杂,由基质细胞及其前体间充质干细胞(MSCs)、细胞因子、细胞外基质等组成。niche主要分为“成骨微龛”和“血管微龛”,前者主要维持HSC静息状态,后者可以调节HSC增殖、分化、迁移等。目前关于MSC对HSC增殖影响的研究较多。骨形态发生蛋白(BMP)-2在造血调控中也起重要作用。此外BMP-2作为重要的成骨因子可刺激MSC分化为成骨细胞,构成“成骨niche”的主体结构,BMP-2还能促进血管的形成,关于它在成骨niche中的研究较多,而其在血管niche方面的作用研究较少。目前关于MSC促进HSC增殖的研究较多,而关于BMP-2对MSC促进HSC增殖的影响的研究较少。 1材料与方法 1.1骨髓来源 骨髓取自健康志愿者。骨髓采集经伦理委员会批准授权,抽取适量骨髓至肝素钠离子抗凝管,充分混匀,均在半小时内使用。 1.2主要实验试剂及其配制、分装和保存 LG-DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、0.25%胰蛋白酶,美国Gibco公司;ECD标记的小鼠抗人CD34、FITC标记的小鼠抗人CDl05、PEcy7标记的小鼠抗人CD45、鼠抗人IgG抗体,美国Pharmingen公司;人CD34+细胞选择试剂盒、miniMACS磁珠分选分离装置、中号分离柱子,Mitenyi Biotec公司;重组人干细胞因子(无菌PBS稀释成浓度为200ng/ml,混匀后分装,-20℃保存)、重组人白介素-3 (PBS稀释成浓度为500ng/ml,混匀后分装,-20℃保存)、重组人骨形态发生蛋白-2(PBS稀释成浓度为1ug/ml,

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