蛋白质分离和监定方法.PDF

蛋白質分離和鑑定方法 國立宜蘭大學食品科學系 張永鍾 維持蛋白質活性 • pH • Detergents – 活性和結構 – 介面活性劑可產生微胞 (micelles ) – 濃度要超過臨界 • Temperature 微胞濃度 (critical micellular – 升溫促使蛋白質結構展開 concentration, CMC) (unfolding)而變性 (denature)) • Trichloroacetic acid, TCA (三氯醋酸) • Protease inhibitors – TCA是極強蛋白質變性劑(無 – 蛋白酶抑制劑 ，防水解 法復原) – 純化蛋白質不用TCA , 是用於 • Reducing agents 沈澱或移除大部分蛋白質 – 還原劑如 mercaptoethanol, – (TCA 腐蝕性極強，皮膚接觸 dithiolthreitol 防胺基酸氧 後要立刻沖水 化(硫氫基) 蛋白質萃取 • Extraction of protein – Sample was homogenized in a physiological buffer (0.05M Na HPO and NaH PO , pH 7.4) containing proteolytic 2 4 2 4 enzyme inhibitors (EDTA, Pepstatin) • Extraction of peptides – Tissue was boiled with 1M Acetic Acid for 5 min – Tissue was homogenized in ethanol / 0.1M HCl (3/1) at 0°C. This will burst open the vesicles to release the peptides in solution. 蛋白質分離方法 • 常見分離技術 – 溶解度差異(沉澱) – 分子量分離 – 鹽析 – 透析 – 等電點沉澱 – 超濾 – 有機溶劑分離 – 分子篩 – 雜蛋白變性 – 電泳 – 吸附分離 – 聚丙烯醯胺膠體電泳 – 離子交換 (PAGE, SDS……) – 親和吸附 – 等電聚焦電泳 – HPLC – 毛細管電泳 鹽析_硫酸銨( (NH4)2SO4)劃分 • 原理 – 高度水合能力的中性鹽類等，奪走蛋白質表面水分子而暴露非極 性區，使蛋白質以疏水力結合聚集沈澱 – 常用硫酸銨、聚乙二醇 (polyethylene glycol ) • 方法