高能X射线照射对肺腺癌细胞A549表达β-微管蛋白-Ⅲ的影响.pdfVIP

青岛人学硕+学位论文 第一章 材料和方法 1．1细胞来源及培养方法 人肺腺癌细胞购自中科院上海细胞库。该细胞系的培养条件：使用含体积分数 1 C02、空气相对湿度95％、 0．10的新生牛血清的RPMI640培养基，在含体积分数0．05 温度为37X3的二氧化碳培养箱中进行培养，每34天传代一次。 1．2细胞照射方法 取对数生长期的A549细胞进行射线照射，照射源为Varian23EX直线加速器， 照射条件：X射线，300 大小。照射前由物理师测量剂量率，对培养瓶进行衰减校正。照射时，细胞培养瓶 置于照射野中心。 1．3细胞采集与观察指标 培养细胞随机为分假照组与照射组，将照射后的细胞又随机分两组，一组细胞 用于细胞免疫组化测§一微管蛋白-III蛋白表达情况，另一组用于RT—PCR检测8一 mRNA表达情况。每一个时间点，每个观察指标设三个平行样本。细胞 微管蛋白一III 免疫组化组照射后继续放入培养箱中培养，24小时、48小时后行SABC细胞免疫组 化，记录B一微管蛋白一Ill蛋白表达情况；另一组照射后继续放入培养箱中培养，分 mRNA表达情况。记录结 别于24小时、48小时后行RT-PCR，记录13一微管蛋白一III 果与未照射组24小时、48小时B一微管蛋白一ⅡI蛋白及mRNA表达情况对比。 根据记录蛋白及mRNA表达情况，数据统计各组有无差异。 1．4免疫组化结果判定 SABC操作步骤按试剂盒要求进行。以PBS代替一抗作阴性对照，已知的阳性切 片作阳性对照。染色结果采用双盲法阅片判断，Olympus光学显微镜高倍镜下随机 选择5个视野，每个视野记数100个细胞。13一微管蛋白一Ⅲ蛋白主要均匀的位于正 常细胞和肿瘤细胞的胞质，呈黄色或棕黄色颗粒，以内皮细胞或神经细胞染色为阳 性参考标准。染色强度O分为无染色，2分为强度至少相当于内皮细胞或神经细胞， 2分以上的细胞为阳性细胞。样品含50％的阳性染色细胞为B一微管蛋白一Ⅲ(一) 即低表达，≥50％阳性染色细胞为多一微管蛋白一Ⅲ(+)即高表达。 3 第一章材料和方法 1．5主要试剂及实验仪器 1．5．1主要试剂 SABc试剂盒及DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)：胎牛血清、 RPMI 1640培养基(杭州四季青生物科技有限公司)；多聚赖氨酸工作液(北京中衫 桥生物技术有限公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)。 1．5．2实验仪器 超净工作台，细胞培养箱，荧光纤维镜(只本OLYMPUSBH一2型)，PAC3000电 泳仪及成像系统，BioMetra 水浴箱等。 1．6实验过程 1．6．1细胞爬片制作 A．细胞免疫组化专用爬片置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗 20遍，再用三蒸水冲洗3遍，烘干后高压消毒，放入超净工作台，备用。 B．专用爬片放入O．1％多聚赖氨酸工作液，室温20分钟，无菌晾干。后放入十 二孔板。 C．经x线照射的各个剂量及假照组的A549细胞经胰酶消化、离心、弃上清、 完全培养基重悬，以2．106／mL密度接种于十二孔板，370c细胞培养箱中分别放置24 小时、48小时。 1．6．2 SABC免疫组化法 A．取出十二孔板，用PBS漂洗爬片2次，每次2分钟。 B．4％多聚甲醛固定爬片，室温下，20分钟，用PBS漂洗3次，每次2分钟。 C．0．5％Txiton X一100室温孵育20分钟，用PBS漂洗3次，每次2分钟。 D．3％H202室温孵育15分钟，用PBS漂洗3次，每次2分钟。 E．试剂盒中山羊血清封闭，37cC孵育，20分钟。 4 青岛人学硕十学位论文 替一抗，37cC，孵育1小时