细胞培养实验技巧.pptVIP

18. 为什么培养基中可以省去加酚红？  酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 19. 如何用台盼兰计数活细胞？  用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 细胞的计数 取一副血球计数板，将计数板载玻片、盖玻片洗干净，擦干。将盖玻片盖在计数板上。 取移液管一支，伸入培养瓶中，轻轻用移液管将细胞悬液混匀（反复吸放移液管橡胶头），然后吸取少量悬液滴一滴于盖玻片与计数板载玻片的边缘上，利用溶液的虹吸现象，使其自动流入计数室内。悬液注入量不应过多或过少，计数室内不应有气泡。滴液不当和产生大量气泡，则须重新洗净计数板，擦干后再次滴入细胞悬液，否则影响细胞计数。 悬液滴入计数室后，静置2～3分钟，待细胞在计数室中下沉后，再在低倍镜下观察计数。依照白细胞计数法，数计数板四角的大方格内的细胞总数，计数时应循一定的路径，以免遗漏或重复计数，对压在格子线上的细胞，根据“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。 按下式计算出每毫升细胞悬液中的细胞数。 细胞数/ml=(四大格中的细胞总数/4)x104 至少重复计数2～3次，取其平均数。如细胞原液经过稀释，则稀释液的细胞数乘以稀释倍数，即为细胞原液的细胞数。 细胞培养 细胞的生长方式及类型 贴附生长型细胞:贴附于底物表面生长的细胞。 ＊上皮样细胞型 ---来源于外胚层和内胚层的细胞，形态为扁平的多角形，胞质近中央处有圆形的细胞核；细胞之间紧密相靠、相互衔接。 ＊成纤维样细胞型---起源于中胚层的细胞，形态似在体内生长的成纤维细胞，有长短不等的细胞突起，多呈梭形、不规则三角形或扇形；漩涡、放射、栅栏状。 ＊其他 悬浮生长型细胞 细胞生长特点 贴附并伸展作用 底物：其他细胞、胶原、玻璃、塑料等 促细胞附着物：基膜素、血清扩散因子等 影响因子：离子作用、机械物理作用 接触抑制 正常的细胞不相互重叠生长，但肿瘤或转化细胞抑制下降 密度依赖性（密度抑制） 细胞的生长特点 原代培养---有限细胞系 人胚成纤维约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维40代；鸡成纤维细胞少数克隆约30代；小鼠的约8代。 传代培养 细胞生长的条件 基本营养物质 氨基酸、维生素、碳水化合物以及无机离子 促生长因子 血清 温度 35℃~37℃ 气相 5%CO2 PH7.2~7.4 用磷酸盐缓冲剂 渗透压 无污染及无毒 微生物污染，不同细胞的交叉污染 细胞培养实验室的设置 无菌操作区 无菌操作室、超净工作台 孵育区 CO2培养箱 制备区 培养液及有关培养用液的制备。 储存区 取放方便，清洁，无灰尘 细胞培养器皿的清洗 1、玻璃器皿---干净，带适当电荷 a.浸泡：新玻璃器皿表面呈碱性，用自来水 初步刷洗，在5%的稀盐酸溶液中浸泡过 夜；使用后的器皿立即浸入清水。 b.刷洗：用软毛刷和优质洗涤剂 c.浸泡：由浓硫酸200ml、重铬酸钾120g、蒸 馏水1000ml配置,由棕红色变为绿色时，表示水分增多或有有机溶剂，应废弃重新配置。 d.冲洗：流水冲洗10次以上，再用蒸馏水洗2~3次。烤干备用。 2.胶塞、盖子、针头的清洗 胶塞、盖子用后及时浸泡，用洗涤剂刷洗； 针头用自来水冲洗后，在2%NAOH中煮10~20min,冲洗干净后1%稀盐酸浸泡30min，冲洗。 细胞系的复苏和培养 1．从低温冰箱中取出塑料冻存管。 2．迅速放入37℃水浴中，并不断摇动，使其急速融化，30s～1min内完成。 3．冻存管用70%酒精棉球擦拭消毒后，打开上盖，用吸管将细胞悬液吸到离心管中。 4. 低速离心（1000r/min）10min，去上清液。再用培养液洗一次。 5．沉淀加10毫升培养液，吹打均匀后再离心10min，弃上清液。 6．加适量培养基后将细胞转移至培养皿中，置37℃恒温箱中培养，第二天观察细胞生长情况。 细胞的传代培养 1．在传代前，首先将培养瓶置相差显微镜下，观察细胞是否已长成致密单层 2．先将培养液、胰酶、培养液放在37℃水浴中，然后用1%新洁尔灭浸泡消毒，再进入无菌室。 3．取将传代的细胞，弃去原培养液，加入0.25%胰蛋白酶1ml，置