细胞破碎方法-非机械破碎法.pptVIP

组合破碎方法有： 多种破碎方法相结合 与上游过程相结合 与下游过程相结合 方法 技术 原理 效果 成本 举例 机械法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中 动物组织及动物细胞 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 超声波法 用超声波的空穴作用使细胞破碎 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模处理 匀浆法（孔型） 须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎 剧烈 适中 细胞悬浮液大规模处理 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠或铁珠捣碎 剧烈 便宜 细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理 细胞机械破碎法 1、 化学（渗透）法 定 义——采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性，使内含物有选择性地释放出来的过程 原 理： 酸碱 有机溶剂 表面活性剂 螯合剂 3.2 细胞破碎方法－－非机械破碎法 （1）作用机理 通过改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来，这种处理方法称为渗透法。 （2）常用的化学试剂 有机溶剂（如苯，甲苯）、抗生素、表面活性（SDS、Triton X-100)、金属螯合剂（EDTA)、 变性剂（盐酸胍、脲）等。 化学渗透法的选择取决于化学试剂的类型、细胞壁和膜的结构与类型 不同的细胞采用不同的试剂处理 化学渗透法 细胞破碎 酸碱 酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。 碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。 碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。 有机溶剂 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 采用有机溶剂，例如丙酮、甲苯等使细胞脱水。如将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至－20℃的丙酮中搅拌，丙酮除能脱水外，还能溶解除去膜上部分脂肪，增大细胞壁的通透性。 EDTA螯合剂：可用于处理G-， 该区域通透性增加 G-的外层膜结构 二价阳离子Ca 2+、Mg 2+与脂多糖和蛋白质的结合 EDTA 大量脂多糖分子脱落 外层膜出现洞穴 内层膜的磷脂来填补 Ca 2+、Mg 2+被螯合 表面活性剂 天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 合成的表面活性剂 离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型） 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 表面活性剂Triton X-100－非离子型清洁剂 其作用部位主要是内膜的双磷脂层。 对疏水性物质有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂， Triton X-100常与其它试剂混合使用。 变性剂：常用的是盐酸胍、脲。 一般认为胍能与水中氢键作用削弱溶质分子的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液（盐酸胍能从大肠杆菌膜碎片中溶解蛋白）。 盐酸胍不仅能改变细胞通透性，而且能溶解不溶性重组蛋白（包含体），并在其它试剂配合下，使其二硫键断裂，变性解离为亚单位。除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链或肽链间的二硫键，再折叠复性成有活性的蛋白质结构。 目前实验室应用较多的是变性剂盐酸胍和脲处理E. coli基因工程菌，渗透出重组蛋白质。 复合试剂 根据不同试剂的作用机理，将介质试剂合理搭配使用，能有效的提高胞内物质的释放率。 如：单独用0.1M的胍处理E. coli，可释放1％的胞内蛋白，用0.5% Triton X-100可释放4％胞内蛋白，二者结合使用，在同样时间内可使53％的胞内蛋白释放。 一般认为胍溶解细胞外膜，使内膜暴露于Triton X-100中，双磷脂层遭受损失，结果大大改变细胞通透性。 原理 细胞类型 变性剂 清洁剂 溶剂 酶 抗生素 生物试剂 螯合剂 G- x x x x x x G+ x x x 酵母 x x x x x x 植物细胞 x x x x 巨嗜细胞 xx x x 不同细胞化学渗透的处理方法 化学渗透法的优缺点（与机械法比较） 1)优点 ①对产物释放有一定的选择性。 化学试剂处理使一些分子量小的溶质（如肽和小分子的酶蛋白）透过，而分子量大的物质（如核酸）则被阻滞在胞内 控制条件可有选择的释出位于细胞不同部位的产物。 ②细胞外形保持完整，碎片少，有利于后分离。 ③核酸释出量少，浆液粘度低，便于进一步提取。 2)缺点 ①时间长，效率低。 一般胞内物释放率不超过50％，处理试剂2h以上，往往还需要添加还原剂（如巯基乙醇）作保护，以防活性损伤太多。 通常为提高收率而采用较高的实际浓度，如一般用6M的盐酸胍或8M的脲来处理E.coli. ②化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。 ③通用性差，某种试剂只