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三、核酸的紫外吸收 260nm 增色效应 减色效应 DNA浓度（ug/ml)=A260/0.02 RNA浓度（ug/ml)=A260/0.024 四、核酸的变性 变性：双螺旋区域氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线条状态 降解：磷酸二酯键的断裂 增色效应和熔解温度Tm 影响Tm的因素 DNA的熔解温度85～90℃ G-C碱基对的含量 Tm=(G+C)%×0.41+69.3 溶液的离子强度 溶液pH 变性剂 DNA的变性方法 热变性 90℃以上 酸碱变性 低于3或者高于10，常用碱变性 化学试剂变性 尿素、甲醛 五、核酸的复性 变性核酸的互补链在适当条件下重新形成双螺旋的过程，又称退火 复性温度(Tm-25o) 影响因素 片断浓度 片断长度 重复序列数目 较低的离子强度 复性的应用：分子杂交 不同来源但是具序列互补性的两条DNA或DNA与RNA或两条RNA通过碱基配对原则结合在一起的过程。 应用于基因标记、定位。例如用带有标记的单链DNA或RNA 做“探针”，通过分子杂交可以从生物样品中查找到需要的DNA或RNA。 通常“探针”都是小片段核酸（寡核苷酸），可以人工合成。 六、核酸的测定 紫外吸收法 定磷法 RNA的测定 DNA的测定 5’-核苷酸的测定 1、紫外吸收法 DNA：A260/A280=1.8 RNA： A260/A280=2 DNA提取时 偏大（RNA污染） 偏小（蛋白质或酚污染） 2、RNA定量测定（苔黑酚法） 样品中蛋白质含量高时，应先用5％三氯乙酸溶液处理后再测定，否则发生干扰； 3、DNA定量测定（二苯胺法） 第五节 核酸的分离纯化 原则 防止核酸酶降解 EDTA 防止化学因素降解 强酸、强碱 防止物理因素降解 高温、剧烈搅拌 一、沉降 超速离心法 65000rpm 6hr 紫外照射 二、凝胶电泳 最常用 琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 影响因素 与分子量对数成反比 与胶浓度成反比 构象：超螺旋DNA线性DNA 电流 第六节 核酸的测序 DNA测序的意义 研究核酸结构和功能的关系 寻找基因和改造基因 疾病诊断 推断蛋白质氨基酸序列 一、末端中止法 将待测DNA加热变性成为单链，作为合成的模板； 加入与模板5’-端互补的短链作为引物； 将样品分为四份，加入四种dNTPs三磷酸核苷的混合物、DNA聚合酶 分别加入ddATP 、ddCTP 、ddGTP、 ddTTP 做反应中止剂； 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段 放射自显影、读序 二、化学裂解法 单链DNA末端标记 分别进行化学裂解 硫酸二甲酯裂解G 甲酸裂解G、A 肼裂解C、T 肼和氯化钠裂解C 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段 放射自显影，读序 本章总结 核酸的基本组成及连接方式 核酸的一级结构 DNA的双螺旋结构要点 RNA的结构(tRNA的结构) 核酸的性质 核酸的测序 完毕！ * * * * * 核酸的简写式 从左向右阅读，表示的碱基序列从5’到3’ pGGTAOH GGTA 六、核酸的水解 碱水解 酸水解:易导致N-苷键水解和碱基脱氨 酶水解 外切酶 内切酶 1、碱水解 RNA用0.3mol/L NaOH在37℃处理16hr 得到2’-核苷酸和3’-核苷酸 DNA在此条件下不发生水解 2、酶水解 核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶 内切酶、外切酶 pApCp↓GpU pAC↓pGp 第二节 DNA的结构 一、DNA的一级结构 定义：脱氧核糖核苷酸在DNA分子中的排列顺序（序列） DNA 基因与基因组 基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物细胞中DNA分子的最小功能单位。 蛋白质（mRNA 蛋白质） 产物 tRNA RNA rRNA 调节功能：调节基因 无产物 作用未知 结构基因 基因组（genome）：某生物体所含全部遗传物质的总和。 二、DNA的二级结构 DNA双螺旋结构的理论基础 1944年艾弗里（O. T. Avery）的肺炎球菌转化实验 恰伽夫（Chargaff）证明在任何类型的生物中腺嘌呤A和胸嘧啶T的比值以及鸟嘌呤G和胞嘧啶C的比值总是接近于1;含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数，即A+C=G+T;嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。 伦敦皇家学院的威尔金斯（Maurice Wilkins）的DNA X射线衍射图像 DNA的双螺旋结构， 由Watson，Crick 于1953年提出。 DNA双螺旋结构的要点1 两条反向平行多核苷酸链，磷酸核糖骨架在外 2.0 nm