《基因克隆1》-课件设计（公开）.pptVIP

基 因 克 隆－I-原理与方法 基因转移、重组与基因工程 自然界的基因转移与重组 　 重组DNA技术 　 肺炎链球菌转化实验－2 1. 将R型菌与S菌的DNA共同培养,得到活的R型菌和活的S型菌,注入小鼠体内： 2. 将R型菌与S型菌的多糖或蛋白质培养,只能得到活的R型菌,注入小鼠体内： 3. 将R型菌与S型菌的DBA和DNA水解酶共同培养.也只得到活的R型菌,注入小鼠体内： 发现：只有完整的S型的DNA才能使R型菌转化为S型菌!  结论：DNA是遗传物质!  已知序列基因克隆策略 2. 外源基因与载体的连接 (1)粘性末端连接： 同一限制酶切割位点连接 配伍末端连接 (2) 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 (3) 同聚物加尾连接 由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 (4) 人工接头 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时。 转化率的影响因素 载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 转化方法： Ca + +诱导转化 106 - 107 / μg DNA 原生质体转化 105 - 106 / μg DNA λ-DNA转染 107 - 108 / μg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / μg DNA 四. 重组子的筛选与鉴定（筛） 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 获得外源DNA片段（分）外源DNA片段与载体连接（接）重组DNA分子转入宿主细胞（转）重组细胞扩增（增）重组子的筛选与鉴定（筛）目的基因的确认与分析 基因克隆的一般步骤 三、重组DNA转入宿主细胞（转） 1．转化（transformation） 特指质粒DNA导入细菌的过程，可分为化学法和电击法。1）化学法转化 原理/方法 转化效率:105～106个转化子/ugDNA (CaCL2法) 应用:可满足一般的基因克隆试验。 大肠杆菌感受态细胞的制备 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化 原理： 高压脉冲,宿主细胞表面形成暂时性微孔,质粒进入 特点： 操作简单，不需制备感受态细胞。转化率极高109～1010转化子／ugDNA任何菌株均适用 应用：可用于文库的构建及其它要求极高的转化。 2）电击法转化（electroporation） 2. 转染（transfection） 指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。 原理： 特点: 转染效率高 107pfu／ug DNA; 外源DNA可整合入宿主细胞染色体中处溶源状态; 应用：常用于文库的构建 获得外源DNA片段（分）外源DNA片段与载体连接（接）重组DNA分子转入宿主细胞（转）重组细胞扩增（增）重组子的筛选与鉴定（筛）目的基因的确认与分析 基因克隆的一般步骤 转化子 重组子 目的重组子 抗性转入获得（多用于筛选转化子） 抗性基因失活 指外源DNA片段插入载体的抗性基因中,致该基因无法正常表达有活性的抗性蛋白。 1.按载体的性状改变进行筛选 蓝白斑筛选(?一互补) 载体: LacZ的调控序列和N端146个氨基酸残基的编码序列(?受体)。 宿主菌: 染色体D