2010-9-6第生二次分子生物学研究方法.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * 基因的差别表达 根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因（house-keeping gene），以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动；另一类叫做发育调控基因（developmental regulated gene），以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化，我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达（differential expression）。 应用mRNA差别显示技术分离克隆目的基因 1992年，美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家P. Liang和A. D. Pardee发明了一种叫做mRNA差别显示PCR（mRNA differential display）技术，简称DDRT-PCR，可以从一对不同类型的细胞群体有效地分离并鉴定差别表达的基因。 应用cDNA差示分析法克隆基因 cDNA差示分析法- RDA法 (Representational Difference Analysis) 充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。 试验对象 （Tester） 供试探针 （Driver） 4碱基切割酶处理 平均长度256bp的代表群 cDNA cDNA 加12/24碱基接头 补平末端 以24碱基的互补序列为引物进行PCR T改换新接头 D不加接头 杂交：T:D=1:100 设计新接头引物PCR 指数扩增产物差异产物 具体流程 （一）目的基因的获取 （二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接 （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 （二）克隆载体的选择和构建 分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。 　　　　　　　　将重点讲述 分子克隆载体的特点; 常见分子克隆载体; 分子克隆载体总述 １、载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力 为外源基因的扩增提供必要的条件 ２、载体特点 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 载体类型 １、质粒载体 ２、噬菌体载体 ３、cosmid克隆载体 ４、噬菌粒载体 ５、酵母人工染色体载体 ６、细菌人工染色体载体 质粒(plasmid ) 独立于细菌染色体外的双链环状DNA分子。 ? ? ? ? chromosome Plasmid 1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。 2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态。 ３、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。 质粒的生物学特性 ４、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200甚至更多个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 6、质粒的不相容：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 T载体的T-A克隆 原理：T-vector两条链的5’端含有一个游离的T， 　　　PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多 　　　加一个A 穿梭质粒载体 （shuttle plasmid vector） 是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标 记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒 载体。 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体 具体流程 （一）目的基因的获取 （二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接 （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 Bam HⅠ切割反应 GGA