基因修饰神经干细胞移植治疗pd的实验研究-外科学(神经外科)专业论文.docxVIP

基因修饰神经干细胞移植治疗PD的实验研究+摘 基因修饰神经干细胞移植治疗PD的实验研究+ 摘 要 f ／ 帕金森病(Parkinson’disease，PD)是～种常见的神经系统变性疾病， 主要症状包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿态不稳，其病理改变为 中脑黑质多巴胺能神经元变性和消失，导致纹状体内多巴胺能神经纤维终 末变性消失及多巴胺水平下降。左旋多巴(L-3，4-dihydroxypheny—lalanine， L．DOPA)能改善症状但不能阻止病情发展，长期应用疗效下降还会出现“开 ．关”现象、剂末现象及运动障碍等。为了获得更好的疗效，必须寻找更为 可靠有效的治疗方法。 酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)是多巴胺(Dopamine，DA)合成 的限速酶，研究发现PD病人的THmRNA和TH含量明显低于正常人。提 高纹状体TH表达有助于增加DA的合成而对PD起治疗作用。目前国内 外已有将TH基因直接转入脑内或通过基因工程细胞转入脑内进行PD治 疗的研究，均取得了不同程度的疗效。土一。) 神经干细胞(Neural stem celIs，NSCs)是指神经系统内具有多潜能、 自我更新、自我维持等特点的细胞，目前已经证实这些细胞确实存在于发 育中的神经系统，并持续存在于成年脑及脊髓。lNSCs可以分化为神经元、 星形胶质细胞、少突胶质细胞等细胞类型。近年、来对于NSCs在神经系统 疾病应用方面作了大量的研究，然而真正直接和有效的策略是直接移植或 作为ex vivo基因治疗的载体细胞。研究人员将中脑来源NSCs植入PD 大鼠纹状体内后，他们能在宿主脑内存活并分化为星形胶质细胞、少突胶 质细胞、神经元，部分神经元表达TH阳性并与宿主细胞建立起稳定的突 触联系，PD动物行为异常得到～定改善。然而无论是在体外还是体内， 本课题为国家自然科学基金资助项目 编号目前的技术均无法将NSCs完全地、特异性地诱导分化为多巴胺能神经元， 目前的技术均无法将NSCs完全地、特异性地诱导分化为多巴胺能神经元， 因此治疗作用非常有限。为了提高移植的治疗效果，我们设想，在体外用 TH基因转染NSCs然后移植入脑，利用NSCs自身的修复和治疗基因的双 重作用，可以起到更好的治疗效果。目前还未见此方面的报道。j、 青天+据弛，脚应用DNA重组技术、细胞培养技术、脑移植技术等方法， 制备TH基因的逆转录病毒表达载体，感染NSCs后，再将表达TH的NSCs 移植入PD大鼠纹状体内，以观察是否对PD起一定的治疗作用，并比较与 单纯NSCs移植的疗效差异，，实验结果如下： 1．包装N2ATH逆转录病毒表达载体并鉴定其在靶细胞中成功表达 2．分离、鉴定孕16天(Embrynoic day 16，E16)Wistar大鼠中脑NSCs。 3．病毒上清感染NSCs后，成功表达TH，NSCs在分化为成熟细胞 后仍能继续表达TH。 4．将NSCs、NSCs／TH移植入PD大鼠患侧纹状体内，术后在不同时 间内检测PD大鼠旋转行为的变化。发现NSCs、NSC“TH移植组旋转行 为均有改善，但NSCs／TH移植组改善更为明显，持续时间更长。 5．术后1、2、4月HPLC．EC检测移植区DA及DOPAC的含量有所 增加，表明移植细胞在局部已释放DA，促进了PD大鼠症状的改善，以 NSCs／TH移植组DA增加更为明显，表明TH基因转染的NSCs移植比单 纯NSCs移植具有更好的疗效。 总之，本实验成功地进行了NSCs的分离、鉴定及体外培养，并完成 了重组逆转录病毒载体N2ATH对NSCs的转染，证实了TH在NSCs及分化细 胞中的表达。TH转染的神经干细胞移植入PD大鼠纹状体后，改善了PD大 鼠的旋转行为，增加了移植区DA含量，且疗效好于单纯NSCs移植组。结 果表明TH转染的NSCs移植可以作为脑内细胞移植治疗PD的供体源，为 PD的治疗开辟了新的方法和途径。、 关键词：神经千细胞酪氨酸羟化酶基因转移帕金森病神经移植 Intracerebral Intracerebral transplantation of genetically modified neural stem cells for Parkinson’S disease Abstract Parkinson’s disease(PD)is characterized by very common degeneration of central nervous system(CNS)．The pathologic feature is that the dopaminergic neurons appea