厚壁孢子根毛霉感染小鼠的组织病理及感染后引起脱毛的免疫机制初步研究-皮肤病与性病学专业论文.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 第一部分 厚壁孢子根毛霉感染患者和小鼠 组织病理像的比较 前 言 毛霉菌病(mucormycosis)又称为接合菌病(zygomycosis)，是由属于接合菌亚门- 毛霉纲-毛霉目-毛霉科（也可由毛霉目中的其他科）中的致病真菌感染人或动物所致。 毛霉菌病通常发生于有基础疾病或免疫功能低下的患者，如糖尿病酮症酸中毒患者， 各种恶性肿瘤及艾滋病患者或因某些原因需要使用免疫抑制剂的患者，表现为机会性 感染，易侵犯血管，尤其是大、小动脉(少有静脉)而导致血管内血栓形成和相邻组织 缺血、坏死，一旦发生，常危及生命。 曹育春等曾于 2005 年 11 月诊治一毛霉菌病患者[1]，其临床表现为右侧臀部、两 侧腹股沟及胰头后方先后出现肿块，伴轻度疼痛，呈进行性加重。后期皮肤肿块处出 现溃疡、坏死、黑痂，伴恶心、呕吐、肝功能异常（图一-A）。病理表现为真皮及皮 下脂肪组织呈弥漫性炎性细胞浸润，其中有较多淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞、 上皮样细胞浸润，组织细胞及多核巨细胞呈不均匀分布，伴有纤维结缔组织增生，部 分血管管腔闭塞、坏死；有趣的是还可见嗜碱性分支不分隔的粗大菌丝，或位于多核 巨细胞内，或组织间隙，或血管管腔内，亦可见少数分隔菌丝和少数嗜碱性厚壁孢子 位于多核巨细胞内（图一-B、C、D）。该菌经中国科学院微生物研究所郑儒永教授鉴 定为厚壁孢子根毛霉（ Rhizomucor chlamydosporus）,为一新菌种，并命名为 Rhizomucor chlamydosporus R.Y.Zheng,X.Y.Liu R.Y.Li ined。该患者最后诊断 为：厚壁孢子根毛霉所致深部真菌病。并以“厚壁孢子根毛霉引起深部真菌病一例” 报道于 2007 年第 11 期中华皮肤科杂志。 毛霉目中的真菌种类繁多，但通常其临床症状和组织病理相一致。病原菌好侵犯 血管，在感染的组织中，常可以见到血管壁内真菌所形成的栓子并可发现粗大、丝带 状、不分隔、直角分支的菌丝，其壁厚薄不均，横断面似孢子，外围无嗜酸性物质沉 积，但偶可见分隔菌丝孢子囊或孢子。本病例两处的组织病理中均可发现少数嗜碱性 的分隔菌丝和厚壁孢子。汪昭贤等曾通过动物实验方法观察三种不同毛霉目真菌感染 家兔的组织病理，发现组织中有孢子[2]。国内学者对由毛霉目真菌感染的组织中是否 存在分隔菌丝和孢子尚有分歧，在上文发表过程中审稿专家对组织中存在分隔分支菌 丝和孢子亦提出异议。针对这一问题，本研究将通过小鼠感染模型再现厚壁孢子根毛 霉组织病理，并比较患者和小鼠厚壁孢子根毛霉感染的组织病理的差别。 材料和方法 一、材料 1.1 材料与试剂，仪器设备 无菌操作台、28℃培养箱、塑料平皿、试管及试管架、一次性注射器、研磨器、 酒精灯、接种环、0.9%NaCl溶液、地塞米松注射液、显微镜、手术器械等。 1.2 实验用真菌 临床分离菌株：厚壁孢子根毛霉（Rhizomucor chlamydosporus），来源于同济 医院皮肤科实验室，从病人感染的组织中分离。 1.3 真菌培养基 沙氏琼脂培养基（沙堡氏4%葡萄糖琼脂）（PH6.0±0.2） 取沙氏琼脂65g（其中蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂15g），加入1000ml双蒸水中， 轻摇数分钟后搅拌加热煮沸至完全溶解，装入三角烧瓶，经115℃高压灭菌15分钟， 待冷却至55℃左右加入氯霉素0.1g，倾注至无菌平皿中，每个平皿约3—5ml，摇匀， 凝固，放入4℃冰箱中备用。 1.4 实验动物 Balb/c小鼠，15-20g，雌雄不限，由同济医学院实验动物研究中心提供。实验前 观察动物健康状况，合乎实验动物健康条件后进行实验。 二、方法 2.1 真菌培养及真菌悬液制备 ①将接种环经火焰灭菌并冷却后，钓取已分离出的真菌，进行平皿接种。 ②将接种好的真菌置入28℃培养箱中培养。 ③观察真菌在固体培养基上的生长表现：48小时即可见菌落生长，呈白色薄膜状， 之后渐增多，第8至9天菌落呈浅黄色棉毛状，长满整个平皿，中间厚，外围薄；第15 天菌落外围与中央厚薄相当。 ④真菌悬液制备：在培养15天的真菌平皿中，取数个直径大于5mm的菌落，置入 含0.9％NaCl溶液的研磨器中，研磨至无成团的菌落存在，震荡均匀，并用标准号为 0.5的麦氏比浊管调整其浊度为0.5麦氏标准浊度(相当于lxl06～1x108CFU／m1)。 2.2 真菌悬液接种小鼠并观察其健康及毛发生长情况 ①取15只15g—20g小鼠，观察其健康状况：皮毛光滑紧贴皮肤，四肢匀称，眼睛 亮而有神。 ②尽量剔除该15只小鼠背部毛发。 ③将其中10只小鼠右侧背部皮下各注射入配制好的真菌悬液0.5m