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碱性磷酸酶Km值的测定 【实验目的】 1.了解酶的Km值测定原理和方法 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测定的原理和方法 【实验原理】 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加，但当底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即： Vmax?[S] V= Km + [S] 其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶的一种方法 将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v－1／[s]作图，将各点连线，在横轴截距为-／km，据此可算出Km值。 1/V=Km/ Vmax?[S] + 1/ Vmax 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应式如下： 磷酸苯二钠+H2O AKP OH- 苯酚 苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色） 【实验操作】 【实验结果】 2、作图 以 [s]为横轴，OD510为纵横作图，观察曲线形状；查Km 值 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图，观察曲线形状；查Km 值 比较两个值的差异. 比较两个值的大小,分析实验误差产生的原因 比较两种Km测定方法各自的优缺点 * * * 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00 底物液 (0.04M) 碳酸缓液(pH=10) 蒸馏水 1 2 3 4 5 6 7 8 管 号 混匀后37℃水浴，预温5分钟左右 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 酶液 加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴），反应开始。 从加入酶液起计时至下一步 加入碱性溶液停止反应，各管反应时间应准确一致，为15分钟。 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 4-氨基安 替比林 铁氰化钾 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 碱性溶液 混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度 1 2 3 4 5 6 7 8 结果记录 OD 1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 - 1/[S] 1/OD 1 3 5 6 8 12 16 0 底物浓度 mmol/L 1、原始数据 [S] 1/2VMAX OD510 VMAX Km 底物浓度与反应速度关系曲线 双倒数曲线 1/[s] 1/OD510 -1/Km 1/Vmax 【实验讨论】 * *