碱性力磷酸酶比活力测定.pptVIP

* * 碱性磷酸酶比活力的测定 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.掌握碱性磷酸酶比活测定的方法 一、目的要求 二、原理 （一）、比色分析法 光的互补示意图 1. 物质的颜色和波长： 可见光：波长（λ）400—760nm 紫外光：λ小于400nm 红外光：λ大于760nm 2. 溶液的颜色和光吸收的关系： 溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。 3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert--Beer定律）： 当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。 4. 待测溶液浓度的计算： （1）标准管法： 在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D）值，然后计算： C未知 =（D未知/D标准）×C标准 （2）标准曲线法： 分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D）之间呈直线关系。以各管D为纵坐标，C为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。 1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ 常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。 （3）消光系数法： （二）、酶活力 在37?C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 ?mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。 酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。 酶活性测定前处理 1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释） 蛋白浓度测定前处理 1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释） 12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照 4-4 37℃，精确反应10分钟 混匀，37℃，5分钟 0.1mL 酶液（mL） 各0.1mL 各0.50mL H2O (mL) 各管加入0.2 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入1.0 mL Na2CO3-NaHCO3 (mL) OD 405 nm 各管加入2.0 mL 0.1 mol/L NaOH (mL) / 酶液（mL） 各0.2mL 5 mM pNPP(mL) 3-3 2-2 1-1 空白（01-04） 管 号