基因芯片筛选骨髓间充质干细胞与软骨细胞的差异表达基因-耳鼻咽喉科学专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：查里k 签字日期：逋年』月上日 学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构 送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 ‘ 论文作者签名： 垫墨丛 指导教师签名：i-,11差1丝 签字日期： 逦年上月L日 基因芯片筛选骨髓间充质干细胞与 基因芯片筛选骨髓间充质干细胞与 软骨细胞的差异表达基因 硕士研究生 ： 赵可庆 指导教师 ： 翟立杰教授 指导小组 ： 王志强教授 专业名称 ： 耳鼻咽喉科学 摘 要 目的：通过筛选大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)与 透明软骨细胞及弹性软骨细胞的差异表达基因，找到在两种软骨中共同上调的基 因，以及在透明软骨中上调而在弹性软骨中下调及在弹性软骨中上调而在透明软 骨中下调的基因，从中找到在MSCs向软骨细胞方向分化过程中起关键作用的基 因，为进一步筛选可诱导MSCs向软骨细胞分化的生长因子打下基础。 方法： (1)采用密度梯度离心法分离SD大鼠的MSCs；采用酶消化法获得SD大鼠弹 性软骨细胞：取SD大鼠肋软骨，剥离软骨膜，收集透明软骨组织。 (2)体外传代培养已分离获得的MSCs与弹性软骨细胞。 (3)分离、培养MSCs与弹性软骨细胞至第三代，采用一步法提取MSCs与 弹性软骨细胞及透明软骨组织的总RNA并纯化，将三者RNA反转录为双链 eDNA，用Cy5．dCTP，Cy3一dCTP分别标记MSCs和软骨细胞的cDNA探针，分别 与两片芯片杂交并清洗，用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪进行扫描后获得的荧 光信号图像用计算机GenePix Pro 4．0图像分析软件进行分析。 (4) 以2倍差异显著性为标准，即cy5／cy30．5为上调基因，cy5／cy32为下 调基因。找出差异表达基因，对所获差异表达基因进行功能查询并结合cy5／cy3 比值找到可能在MSCs向软骨细胞方向分化过程中起关键作用的基因。 结果： (1)MSCs经形态学及流式细胞仪鉴定符合实验要求。 (2)MSCs与两种软骨细胞的总RNA的OD260／OD280都介于1．80与2．0之 间，且三组RNA的电泳条带清晰，28S比18S的亮度接近2：1，三份样品的纯度 符合要求，亦无降解。 (3)在透明软骨组中找出差异表达基因2148条，其中上调基因1041条，下 调基因1 107条。在弹性软骨组中找出差异表达基因21 14条，其中上调基因1226 条，下调基因888条。在两种软骨中共同上调的基因数为582条，共同下调的基 条，下调基因888条。在两种软骨中共同上调的基因数为582条，共同下调的基 因数为612条，而于透明软骨组中上调，弹性软骨组中下调的基因数为459条， 在弹性软骨组中上调而在透明软骨组中下调的基因数为345条。 (4)对所获差异表达基因进行功能查询并结合cy5／cy3比值后在与软骨分化 相关的差异表达基因中筛选出了ey5／cy3比值最高，差异显著性最大的一组差异表 达基因：软骨调节素1(chondromodulinI，Chml)基因、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)基因、前U型胶原Q 1链(procollagen，type2， alphal，Col2a1)基因、软骨同源异型蛋白1(cartilage homeoprotein 1，Cartl)基因、 基质金属蛋白酶3(matrix metallopeptidase3，MMP3)基因及基质金属蛋白酶抑制因 子3(tissue in hibitors ofmetalloproteinase3，TIMP3)基因。他们为本文研究的目标 基因。 结论： (1)骨髓间充质干细胞和软骨细胞的基因表达谱存在显著差异。 (2)诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化可通过多种生长因子的协同作 用，上调或者下调某些关键基因的表达来实现。