基因工程下游标准化体系工艺技术研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要基因工程产品的生产是一项十分复杂的系统工程，可分为上游和 摘要 基因工程产品的生产是一项十分复杂的系统工程，可分为上游和 下游两个阶段，以分离目的基因、构建工程菌为主要内容的上游工艺 是研制基因工程产品必不可少的基础，而作为下游工艺核心内容的工 程菌的发酵培养、目的蛋白的分离纯化却直接控制着整个基因工程产 品的质量、产量。本课题利用基因工程技术，重点从基因工程下游阶 段着手研究，利用最新现代生物技术研究并建立经优化的高密度发酵 工艺模式及高效分离纯化包涵体重组蛋白模式。 一．研究并建立一种适于目的蛋白高效表达的高密度发酵工艺模式 高密度发酵中，人们最关心的问题主要是质粒稳定性的维持、外 源基因的高效表达及对下游纯化的影响。针对这些问题，我们采用分 批补料培养的方法优化发酵培养基配方及部分发酵条件，探索出即适 于外源基因高效表达，又利于产品纯化的发酵工艺。以我室构建并稳 定表达的重组质粒pBV220一v—IFN、pBV220-HGFcL、pBV220一HeFt,、 pBV220一hPK5为模型，分别从不同的表达宿主菌中筛选出一种适合大 规模生产的菌种BL21(DE3)，该工程菌株连续传代100代表达质粒不 丢失，表达量稳定；采用B．Braun公司的BIOSTAT—C15L自控发酵罐， 运用分批补料技术分别进行四种工程菌的高密度发酵，通过优化工程 菌发酵的培养基配方及优化部分发酵条件(通气量、搅拌速度、补料 速度)，最终建立～种适于目的基因高效表达的高密度发酵工艺模式。 发酵密度00．,=40--42，SDS—PAGE及凝胶密度扫描分析目的基因产 物占菌体总蛋白20％以上。 二．研究并建立一种包涵体中高效分离纯化目的蛋白的优化模式 重组蛋白分离纯化工艺中分离效率的提高、生物活性效率的提高 及工艺的稳定性是尤其重要的，针对这些问题，我们在层析纯化前尽 可能地提高包涵体纯度，并选择合适层析方法的同时合理的组合色谱 可能地提高包涵体纯度，并选择合适层析方法的同时合理的组合色谱 分离单元。以大肠杆菌内包涵体形式表达的重组蛋白重组人rIFN、 HGFa、HGF6、hPK5为模型，系统研究包涵体的洗涤及其色谱层析纯化 工艺，采用超声接合溶菌酶法破碎菌体后，用含有低浓度尿素的包涵 体洗涤液反复超声洗涤，采用最新反相色谱纯化技术SOUCE30RPC分离 包涵体蛋白，经sDS—PAGE及凝胶密度扫描分析，目的基因产物占菌 体总蛋白的90％以上，杂蛋白明显减少；包涵体复性后，采用AKTA purifier层析仪、Sepharose Fast Flow、Sephacrayl系列凝胶填料 以及Hitrap Selection Kit及XK型系列层析柱利用不同目的蛋白的 各种理化特性不同运用三步纯化策略对重组人y-IFN、HGFq、HGF6、 hPK5分别进行高效色谱纯化，筛选优化条件从而建立了一种有效的从 包涵体中分离纯化目的蛋白易于放大的工艺模式，纯化产物纯度98 ％。 结论： 总之，通过对发酵罐中重组工程菌各种培养因素的研究，建立了 一种高密度、高表达发酵工艺体系，为重组蛋白的后续纯化提供了大 量、稳定的原料供应：通过对不同目的蛋白的色谱行为的系统研究， 建立了一种高效稳定、快速简洁、易于放大的包涵体重组蛋白分离纯 化体系。目前，利用基因工程技术生产目的蛋白已在我国得到广泛发 展，对于重组产物而言其下游工艺尤其重要，本课题为基因工程下游 发酵、纯化工艺路线探索出一个切实可行的程序，同时也为基因工程 产品产业化放大提供了一个有益的借鉴。 关键词： 分批补料高密度发酵包涵体纯化重组人y一干扰素 重组人肝细胞生长因子 AbstractThe Abstract The production of genetic engineering product is a very compl icated systematic projects，and can be div[ded into two stages in the upper reaches and the lower reaches．The upper reaches technology including separate the target DNA and construct the engineering bacteria is the indispensable foundation of developing genetic engineering product：and the output and the quality of the genetic engineering product is