基因工程小肽——[gly14]-humanin及人胰岛素突变体原核表达克隆的构建、表达及初步纯化-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

山西医科大学 山西医科大学 2003届硕士学位论文 摘 要 目 的 1．基冈T程[Gly ]-Humanin原核表达体系的构建、表达及初步纯 化 2．基冈T程人胰岛索突变体原核表达体系的构建、表达、初步纯化 及测活 方法 采Ⅲ基因丁程手段，基冈合成法分圳获得[GIy“]-Humanin(HNG)及人 胰岛素突变体(M-insulin)的cDNA序列，构建了pBV220一HNG、pTXBI-HNG 及pTXBI--M—insulin原核表达质粒，基冈测序确定质粒的正确性。 二个质粒转化人肠杆越T程菌株，诱导表达，Western-Blot鉴定目 的蛋向。 采州超声加洗涤液破碎凿体；离心加冻融分离纯化融合蛋白，研究 不同的超卢次数和冻融对包涵体洗涤效果的影响。 放免法测定人胰岛素突变体融合蛋白的活性。 结果 1．克隆构建 成功构建了pBV220--HNG、pTXBI—HNG及pTXBI--M—insulin三个 质粒，基冈测序显示重组质粒的人小、方向、阪度均止确。pBV220--HNG 在人肠杆菌中朱检测到表达，后两个克隆在人肠杆菌BL21(DE3)中获 得高效表达，HNG及M-insulin融合蛋白表达量分别占全菌蛋白的40％ 及50％左右；经Western—Blot鉴定M-insulin融合蛋白可以与小鼠抗 人胰岛素单克隆抗体(IgG)发生抗原抗体结合反麻。 2．T程凶表达条件的研究 山西医科大学 山西医科大学 2003届硕士学位论文 —i；■■●■i暑i#；；j《iii#■|■■■j《■i■i宣日i■葺■皇■■■目■■■o#■一III●i■■●—■■■■■■■|■—■_ 表i菌株BL21(DE3)--pTXBI—H黼及BL21(DE3)一pTXBI～ M—insulin均往瓿臻葬基，3TC、200rpm耩床靖葬4小时45分时进入 对数生＆中纛崩，托辩据入终浓度0，Olmmol／L的IPTG开始诱导，爵持 续臻莽5小辩可逸鲻壤又表达鬣。 3．袭达产物初步纯化 [GIY“卜Humanin融合缀白和人胰岛索突变体融合馐白包涵体的洗涤 方寨为：菌体沉淀溶r含2mol／L尿素洗涤液，超声(200W、150次、3 秒／次、间隔3秒)，4℃、10000rpm离心15min后沉淀用洗涤液充分鹫 悬．一20C冻存过夜，次日融化屙4C、10000rpm离心15min，墩上清， 豫褥鳓扔步纯仡的融台蛋向，可玄除主鬻的杂蛋向，融合蛋向溶解于上 清液中，纯度这到80％以上。 4．活性测定 采_HJ放射免痰法。对人胰岛素突变体融合蛋自初步纯化产物，进行 放免计数。缩果：每升诱导培养后的菌液表达产物中．具有的放射免疫 活性为0．5单位。 缕、论 成功输簿了pTXBI-I,ING及pTXBl-M-insulin原核表达克隆，弗获褥 了离效夜迭，经遗纯蕾艺襻劐纯发天≯80％的融合虽冉，弗对入胰岛索突 变体融台蛋舟遴行了初步{嚣瞧瓣定。为阁融合表达方式表这小分子麓多 获及规模仡翻备小分予蛋自奠迩了柄步的实验和灌论蒸础。 关键词 Humanin胰岛素突变体内堂向予小分子鼙多肽融合表达 山西医科大学 山西医科大学 2003届硕士学位论文 High Expression of Recombinant【G哆¨1-HumaniR and human insulin mutant in EscheHchia coli and PuHficafion Abstract objective 1．Construction of prokaryotic high expression of[Glyl4卜Humanin (HNG)and its expression and purification． 2．Construction of prokaryotic high expression。vector of human insulin mutant (M-insulin)and its expression，purification and bioassay． Methods By gene synthesis，we get the cDNAs甜[Gly“】．Hurnanin and human insulin mumnL and then three pmkaryotic expression vectors：pBV220-- lING．pTXBl一HNG and pTXBl一M-insulin by DNA polymeraSe chain reaction(PCR)and DNA recombinant technics．Th