华支睾吸虫溶血磷脂酶基因（lysopla）的克隆表达及其功能的初步分析-病原生物学专业论文.docxVIP

●^年礓士季值{}文华支睾吸虫溶血磷脂酶基因(LysoPLA)的克隆 ●^年礓士季值{}文 华支睾吸虫溶血磷脂酶基因(LysoPLA)的克隆 表达及其功能的初步研究 硕士研究生： 梁柏年 导 师： 余新炳教授 中山大学基础医学院病原生物学部 广州 510080 摘 要 研究目的 华支睾吸虫(Clonorchis sinensi∥又称肝吸虫，成虫寄 生于肝胆管内，可引起华支睾吸虫病(clonorchiasi0，又称肝吸虫病。主要流行 于东南亚地区，全世界估计有2800万病人。我国有华支睾吸虫感染者近2000 万，广东省为主要的高发区，估计感染者约500万人。 本实验从华支睾吸虫成虫cDNA文库中克隆出一个新基因 一溶血磷脂酶基 因(1ysophospholipase，lysoPLA)，溶血磷脂酶是一种作用于生物膜上作为调节 控制多功能溶血磷脂酸的酶，其作用主要是水解溶血磷脂酸，在宿主患病时能提 高溶血磷脂酸的表达水平。1。而溶血磷脂酸在磷脂的新陈代谢中发挥着类除垢剂 的作用，其在生理学上和病理学上发挥着重要的作用““。本研究希望通过克隆 表达溶血磷脂酶基因，并对其功能进行初步的研究，为研究华支睾吸虫疫苗提供 理论和实验依据。 研究内容 包括lysoPLA基因的克隆表达、蛋白免疫大白鼠后的免疫 反应。 方法①华支睾吸虫lysoPLA基因的体外扩增、克隆 通过华支睾吸虫 成虫cDNA文库筛选识别华支睾吸虫新基因，以cDNA文库为模板进行PCR扩增出 ●一年碛士学位静文IysoPLA基因的编码区序列，I．096的琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR产物、质粒 ●一年碛士学位静文 IysoPLA基因的编码区序列，I．096的琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR产物、质粒 pGEX-4T-1分别酶切、回收，后进行连接、转化、初筛、PCR与酶切鉴定。构建 pGEX—lysoPLA原核表达重组质粒，经酶切和PCR鉴定，并进一步用CaCI：法转化 到大肠杆菌B卜21中，对转化的大肠杆菌进行验证；②华支睾吸虫lysoPLA基因 的原核表达和纯化 利用IPTG诱导大肠杆菌表达出lysoPLA基因，经SDS—PAGE 电泳鉴定表达产物，表达产物大小与预测结果相符，证实lysoPLA基因可以在原 核生物E coli B1-21中进行表达。根据表达载体pGEx_4T_l的特性。其表达的 蛋白具有GST(glutathione-S-transferase，谷胱甘肽．s一转移酶)的特异标签， 利用BD(肋Biosciences Clontech)公司的GSTtrap蛋白纯化柱，对表达出的目 的蛋白进行纯化处理；⑧lysoPIA纯化蛋白免疫大白鼠所诱导的免疫应答 利 用纯化的蛋白，结合福氏佐剂对SD大白鼠进行蛋白免疫，在大鼠的腹部和大腿 内侧的皮内进行多点注射免疫。在初次免疫两周后加强免疫，两周后杀鼠，眼眶 取血，所得的血清作为Western-blot的一抗，另用辣根酶标记的山羊抗大鼠 IgG／HRP作为二抗进行Western-blot蛋白印迹反应，以鉴定免疫反应性。 结果①华支睾吸虫lysoPLA基因的体外扩增、克隆 利用PCR法以重 组质粒pGEX—IysoPLA为模板进行PCR扩增，获得了lysoPLA基因扩增基因片段， 证明克隆质粒pGEX-IysoPLA含有目的基因片段。另经酶切、测序及PCR鉴定， 成功构建表达质粒pGEX-IysoPLA；②华支睾吸虫lysoPLA基因的原核表达和 纯化 对表达的蛋白进行SDS电泳，结果显示有一条靠近50kDa左右的 电泳条带，与预测值(51kDa)相近。证实在大肠杆菌成功表达出lysoPLA蛋白。对 纯化的蛋白进行SDS电泳，也得到了一条靠近50kDa左右的电泳条带，与 预期分子大小相符。@lysoPLA纯化蛋白免疫大白鼠所诱导的免疫应答 用 免疫的大白鼠血清作为一抗进行的Western-blot蛋白印迹反应，结果在纯化蛋 自的泳道上出现一条靠近50kDa左右的条带，可见有特异性抗原一抗体反应，而 在未诱导的泳道上则为阴性结果。 结论 成功构建了含lysoPLA基因的原核表达重组质粒，并诱导表达出 Ⅱ ●柏鼻曩士学位论文华支睾吸虫的lysoPLA融合蛋白，在动物免疫中得到阳性结果，证明融合蛋白有 ●柏鼻曩士学位论文 华支睾吸虫的lysoPLA融合蛋白，在动物免疫中得到阳性结果，证明融合蛋白有 抗原一抗体免疫反应性。有关溶血磷脂酶在华支睾吸虫中的作用以及其在预防、 治疗华支睾吸虫病的意义有待进一步的研究。 关键词 华支睾吸虫，溶血磷脂酶，基因克隆，原核表达，蛋白免疫 IH ●一年取士膏位静文Cloning、Expression ●一年取士膏位静文 Cloning、Expression and Primary identificat