基因工程th17细胞的研制及其功能的探讨-内科学(血液病学)专业论文.docxVIP

徐州医学院硕士学位论文RORrt 徐州医学院硕士学位论文 RORrt PAR．related orphan receptor gamma t 维甲酸相关孤儿受体丫t RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 TGF—p Transforming growth factor-J3 转化生长因子一B 秭s Hydroxymethylaminomethane 三羟甲基氨基甲烷 VSV．G Esicular stomatitis virus glycolprotein 水疱性El炎病毒糖蛋白 2 徐州医学院硕士学位论文基因工程Thl7细胞的研制及其功能的探讨 徐州医学院硕士学位论文 基因工程Thl7细胞的研制及其功能的探讨 中文摘要 目的 通过慢病毒介导小鼠CD4+CD25。naive T细胞过表达RORrt基因，同 时结合TGF-p和IL．6，探索和优化制备高纯度Thl 7细胞的方法，并评价其是否 具有类似天然Thl7细胞的功能。 方法 1．小鼠RORV基因的克隆及重组慢病毒载体pXZ9．RORyt的构建： Trizol法提取C57BL／6小鼠胸腺总RNA，经MLV反转录酶反转录获得小鼠胸腺 cDNA；以小鼠胸腺cDNA为模板，使用PCR技术扩增小鼠ROlⅫ基因片段，并 将其克隆至载体PCR2．1，酶切及测序鉴定；酶切获得纯化的RORyt基因片段， 亚克隆入载体MigRl，酶切回收纯化的ROI冲-IRES-GFP片段，连接入慢病毒载 体pTK208，酶切鉴定正确阳性克隆，命名为pXZ9-RORTt。2．重组慢病毒颗粒的 包装及RORa,t基因在293FT细胞中的表达：使用脂质体转染法将慢病毒三质粒包 装系统共转染人胚肾细胞系293FT包装细胞，分别于转染后48h、72h收集慢病 毒上清，超速离心浓缩慢病毒颗粒有限稀释法测定病毒滴度，．80℃保存备用。 使用重组慢病毒颗粒pXZ9．RORrt感染293FT细胞，荧光显微镜观察EGFP蛋白 的表达，Western．blot鉴定小鼠RORrt蛋白的表达。3．重组慢病毒感染淋巴细胞 的条件优化：淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏单个核细胞，免疫磁珠分选获得小鼠 CD4+CD25。T淋巴细胞，设立四个实验组(各设三个复孔)行原代淋巴细胞的感 染条件摸索，分别为：ConA组(培养基中加入CortA使终浓度5 p幽：IlL)；CD3 组(细胞接种于提前使用浓度为5}tg／mL的抗小鼠CD3e抗体包被的24孔板)； CD3+CD28组(细胞接种于CD3￡：抗体预处理的24孔板，加入抗小鼠CD28单抗 使终浓度为1 pg／mL)：CD3+CD28+IL．2组(在CD3e抗体、CD28抗体存在的 条件下，加入IL-2至终浓度为10 rtg／mL)；空白对照组(将CD4+CD25。naiveT细 胞接种于含10％FBS的1640培养基中)。37℃、5％C02浓度下培养。待细胞培 3 徐州医学院硕士学位论文养至36 徐州医学院硕士学位论文 养至36 h，加入浓缩的慢病毒颗粒使MOI=3，并加入聚凝胺促进病毒吸附，2000 r／min离心2 h后常规培养。取感染后72 h细胞，荧光显微镜观察GFP阳性细胞 率。综合评价后选感染效率最高的培养方法应用于下游实验。4．工程Thl7细胞的 制备及功能鉴定：将CD3+CD28+lL一2共同刺激培养36 h的CD4+CD25’naive T 细胞分别分为4个实验组(各设三个复孔)，分别为：pXZ9．RORyt组(单纯使用 重组慢病毒颗粒pXZ9一RORyt感染后细胞)；TGF．13+IL一6组(pXZ9慢病毒颗粒 感染后细胞加入TGF—p和IL-6培养)；联合组(pXZ9．R01Ⅻ慢病毒颗粒感染后 细胞于含TGF．p和IL．6的培养基中培养)；空载体对照组(单纯pXZ9慢病毒颗 粒感染后细胞)；各组细胞培养3天后，流式细胞术分选GFP阳性细胞，鉴定各 实验组lL．17qFN-1,细胞比例，荧光定量PCR技术鉴定各组细胞IL．17A，IL．17F， IL．21，IFN—y转录水平。使用弗氏完全佐剂溶解MOG多肽联合百日咳毒素，免 疫C57／BL6小鼠，建立小鼠实验变应性脑炎(EAE)模型，同时尾静脉注射各实 验组细胞，每日观察小鼠状态并进行临床评分，评估基因工程Thl7细胞是否具 有加重EAE的功能。 结果 1．经酶切鉴定及测序结果证实，成功构建pXZ9．RORyt重组慢病毒载 体，脂质体包装的重组慢病毒颗粒经超速离心浓缩后浓度达108IU／mL；浓缩的病 毒颗粒pXZ9一ROR丫t感染293FT细胞后成功检测到RORrt蛋白。2．经免疫磁珠分 选后，CD4+CD25。淋巴细胞阳性率可达95％以上。行淋巴细胞感染条件探索，荧 光显微镜观察各实验组GFP阳性