组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基对酶活性.PDF

·661· 组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基对酶活性 的作用 刘 剑 基金项目：广东省科技计划项目资助(项目编号：20088060600055) 作者单位：510006广州，广东药学院生命科学与生物制药学院 作者简介：刘剑(1970一)。男，博士，讲师，研究方向：蛋白酶研究。E—mail：jianldzyj@gmail．tom [摘要] 目的探讨组织蛋白酶E第284位苏氨酸残基在酶活性中的作用。方法通过基因点突变， 将大鼠组织蛋白酶E内羧基端的活性部位基序中第284位苏氨酸残基用丝氨酸进行替代，构建变异体 T284S。结果当将野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E基因在HEK293T细胞中进行异源表达时，在细胞 培养基和细胞提取物中都发现有野生型和变异型的大鼠组织蛋白酶E的酶原蛋白表达。突变体T284S仍具 有自我转化为成熟型酶的能力，尽管它们的酶活性只是野生型的40％，变异体的Km值与野生型的相似，但它 的Keat值却比野生型显著下降。变异体和野生型酶都被胃酶抑素和蛔虫胃蛋白酶抑制剂所抑制，l(i值几乎 相同。变异体在各种酸碱度下的圆二色光谱与野生型基本相同。结论 (1)第284位苏氨酸残基对酶的催 化活性确实非常重要。变异体T284S酶催化活性的下降是由于多出来的甲基使活性部位氢键的分布发生改 变，从而使酶与底物的作用模式发生改变。(2)BACE一1不能被胃酶抑素抑制，可能与羧基端结构域的活性 部位基序差异无关，而与BACEl蛋白结构中的其它部分有关。 【关键词】 活性部位基序； 天门冬氨酸蛋白酶；组织蛋白酶E；变异体解析 [中图分类号]R963[文献标识码】 A[文章编号】1674—3806(2009)07—0661—05 doi：10．3969／j．issn．1674—3806．2009．07．01 in of TheroleofThr284the ELIU Scienceand catalysisCamepsin Jian．SchoolofLife Biopharmacology， Guangdong College，Guangzlwu510006，China pharmacological To the of11ar284in of role the E．Methods [Abstract]Objectiveinvestigate catalysisCathepsin Replace Thr284witha to aT284Smutantsite—directed serine Bothwild andmutant produce by mutagenesis．Resultstype in HEK cellculture and tO and the 293T mediacell isstillableautoactivate． a陀expressedpresent lysate．Mutant its is 40％ofthatofwild Kmvalueofmutantissimilartothatofwild its althouglI activityonly type．The type，but ／(eatvalueissmallerthanthatof耐ld mutantandwild areinhibited andAscaris type．Both type bypepstatin