细胞培一养技术每代细胞.pptVIP

每代细胞 每代细胞 滞留期 lag phase 概述 传代:恢复期 适应期 原代培养:开始时细胞 必须经历的时期 2种情况 分散细胞接种:游离- - 吸附- -潜伏期 组织块: 潜伏期 滞留期 原因:操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物 黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤 接种细胞: 适应，恢复，积累(代谢中间产物)组织块: 细胞迁移出一般经数小时- -几天 滞留期 过程: 游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形 吸附:贴附底物,一般24小时内  贴壁 潜伏期:可有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相 滞留期 影响因素滞留期的长短与细胞种类、按种的细胞密度、培养条件等因素有关。1.细胞密度 接种分散细胞,接种的密度越大、数量越多，  细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。 相反，即便是在很小的培养空间内， 如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长 滞留期-影响因素 2.细胞类型传代培养的细胞之滞留期 比原代培养的细胞短。 单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢连续细胞系与发生恶性转化的细胞 比有限细胞系与正常二倍体细胞的短来源 胚胎组织:短,  成体:长 滞留期-影响因素3.细胞机能状态 不良者慢4.培养条件 培养液,pH,底物 不利:污染,有毒 指数生长期 exponential (log) phase 概述 潜伏期结束后 即开始指数生长期， 或称对数生长期。 细胞生长所需 各种营养条件具备后进入 特点 是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段 培养物中细胞数量呈指数增长, 细胞群体均一 实验理想 判断细胞生长的指标 判断细胞生长的指标指数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性) 可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标 1.有丝分裂指数(MI):培养物中分裂相数量占 全部细胞数量的百分比 统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。 一般细胞的MI约为0.1~0.5% 原代培养物的MI比继代培养物低。 连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%~5%。 2.细胞群体倍增时间:培养物中细胞数量翻倍的平均时间 间接反映细胞活力和增殖活动强弱，有 3.MTT法：反映细胞内一种酶活性程度 4.标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：反映DNA合成 细胞的增殖活性与细胞种类、供体年龄以及培养条件等多种因素密切相关。 细胞生长一定阶段(指数生长期一般持续3~5 d）,即可长满培养器皿，相互汇合成片 (铺满 confluence汇合) 铺满：细胞彼此连接成层长满器皿底壁。(细胞相互之间紧密接 触，所有可供生长的区域己被利用)。正常细胞(非转化细胞)，当细胞相互接触 连接成片，出现接触抑制 接触抑制以后，虽然运动受抑制， 但只要营养成分充足，仍可短期的分裂增殖 只有当细胞密度增大到一定程度， 细胞便不再分裂增殖。 为密度依赖性细胞生长抑制 当细胞分裂停止后，细胞数量即不再增加 进入平台期 平台期 Plateau (stationary) phase 概述 细胞铺满后再1-2倍增, 进入 细胞达饱和密度, 可存活 仍有代谢活动，但基本不分裂 细胞数量维持在某一水平上， 生长活动停滞. 饱和密度：在培养细胞的平台期，可供细胞 生长的底物面枳己被生长的细胞所占滿，细 胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。细胞数目 不再增加时，即达细胞生长的饱和密度 特点 (1)细胞数量 细胞达饱和密度 密度抑制 停止生长原因: 细胞数量多、生长地区占满、 营养消耗、培养液中代谢废物积聚渐多 细胞停止生长。即使经常更换培养液， 细胞也会变性,从生长基质表面脱落、死亡 唯有进行传代方可缓解 特点 (2)细胞活动小, 细胞膜的活动小(3)生长组分下降: 0~10%(4)及时转代 若细胞已中毒，即使传代， 也会影响下一代细胞的功能状况 培养细胞的生长曲线 培养细胞都可在接种以