生长因子及mapk途径对生长板软骨细胞增殖和分化的影响-生物医学工对程专业毕业论文.docx

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 暨南大学 或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字目期：．砂f年∥月8日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解暨南大学 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 旁阳 鹕丁 签字日期： 日 导师签名： 戥誉 刘瓤 锗少者矿 孙年 囝盯 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 中英文摘要生长因子和MAPK途径对生长板软骨细胞 中英文摘要 生长因子和MAPK途径对生长板软骨细胞 增殖和分化的影响 博士研究生： 季煜华 导 师： 曾耀英研究员 摘要 第一章大鼠肋生长板软骨细胞的分离、培养及生物学特性的研究 目的：建立大鼠肋生长板软骨细胞的体外培养模型，探讨其在体外培养条件 下的生物学特性。 方法：显微解剖分离出大鼠肋生长板，酶消化法(O．05％透明质酸酶和O．2％ II型胶原酶)获得分散的大鼠肋生长板软骨细胞(rat costochondral growth plate chondrocyte，RGC)，常规接种，单层培养。对原代～第5代RGC进行生长动 力学分析，并通过免疫细胞化学、阿尔新兰染色和Western blot检测原代～第5 代RGC中II型胶原、d—SMA和蛋白多糖的分布和表达。 结果：原代培养的生长板软骨细胞中95％以上的细胞Ⅱ型胶原阳性染色，细 胞核周围和细胞膜周边都有II型胶原的阳性染色，阳性染色的纤维包裹着细胞 核，保持圆形的细胞强阳性染色。随着传代次数的增加，表达II型胶原的细胞比 例和表达量下降，第6代RGC中仅保持圆形的细胞仍呈阳性染色。原代培养的 RGC表达大量的蛋白多糖，阿尔新兰阳性染色。第2，3代阿尔新兰染色减少， 3代后阿尔新兰染色皆呈阴性。原代RGC中，n．SMA的表达很弱，随传代次数 增加，q—SMA的表达量逐渐增高；Ⅱ型胶原的表达刚好和n．SMA相反，原代 RGC表达最强，随着传代次数的增加，表达逐渐下降。 结论：成功建立大鼠肋生长板软骨细胞的体外培养模型。单层培养的RGC 在第4代后逐渐失去分化表型，n．SMA可以作为RGC去分化的一个新的标志 物。 中英文摘要第二章生长因子及其组合对RGC增殖和分化的影响 中英文摘要 第二章生长因子及其组合对RGC增殖和分化的影响 目的：检测生长因子及其组合对传代培养RGC增殖和胶原合成的影响，并 探讨连续传代引起的去分化对其作用的影响，为最终建立RGC的无血清培养体 系奠定实验基础。 方法：以传代培养的RGC作为实验的模型，通过3H．TdR、3H．Profine和 35S-Sulfate掺入的方法检测L．AA、bFGF、IGF-I、TGF—B 1、TGF．0 3、EGF以 及它们的组合对无血清培养的原代～第4代RGC增殖、胶原和蛋白多糖合成的 影响，RT-PCR检测生长因子及其组合对RGC aggrecan和collagenIImRNA转录 的影响。 结果：对于原代培养RGC，ZS}lg／mL，50pg／mLL-AA促进10％FBS培养RGC 的增殖和胶原合成，但强烈地抑制无血清培养RGC的增殖和胶原合成，因此以 下的实验中培养基中均未添加L广AA；本实验所检测的5种生长因子均具有不同 程度促进原代RGC增殖和胶原合成的作用，其中bFGF的促增殖能力最强，是 无血清对照组的6倍左右，高于10％FBS；TGF-0 l促进胶原合成能力最强，是 对照组的1．5倍左右，低于10％FBS。10J_tg／LbFGF、1009／LIGF—I和1I．tg／LTGF- 0 1组合的促增殖、胶原和蛋白多糖合成的作用相当或接近于10％FBS的作用。 生长因子及其组合对RGC增殖和胶原合成的促进作用随着传代次数的增加均呈 下降的趋势。 结论：bFGF、IGF．I、TGF-B 1、TGF-B 3和EGF均可不同程度地促进原 代RGC的增殖和胶原合成，生长因子的组合(10峙，L bFGF，10 J_tg／L IGF-I和 l“g／L TGF．B 1)对RGC增殖、胶原和蛋白多糖合成的促进作用相当或接近于 10％FBS的作用，可以替代血清实现RGC的无血