华支睾吸虫cssccro基因的发现及其功能初步研究-病原生物学专业论文.docxVIP

赵玉利硕士学位论文 赵玉利硕士学位论文 中文摘要 尽管有充分的证据表明，华支睾吸虫的感染是引发肝胆管癌的一个重要因 素，但是至今仍缺乏明确的分子水平的实验证据；另一方面，华支睾吸虫是否存 在与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似的基因，是否也具有与其相类似的作用? 都值得进一步探讨。 研究目的 从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似 的基因，探讨其与肝胆管癌发生、发展的关系，为华支睾吸虫感染引起肝胆管肿 瘤提供分子生物学依据，同时丰富华支睾吸虫基因组学和功能基因组学研究。 研究方法 l华支睾吸虫CsSCCRO基因的发现和生物信息学分析 从华支睾吸虫成虫cDNA文库测序后unigene归并、拼接，获得与人鳞状上 皮癌相关肿瘤基因相类似的基因，暂命名为CsSCCRO。测序、分析是否为全长 基因，然后利用生物信息学分析软件对此基因的cDNA序列进行结构、性质和 功能分析，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析、以及推导的DsccRO蛋 白的理化性质及空间结构分析。 2华支睾吸虫CsSCCRO基因克隆、表达和Western—blotting鉴定 2．1华支睾吸虫成虫CsSCCRO基因的扩增、克隆 根据目的基因的ORF和原核表达质粒pET-30a(+)设计引物，PCR扩增 CsSCCRO基因的cDNA全长编码区。限制性内切酶Xho I、EcoR V双酶切空质 粒pET-30a(+)矛D PCR产物，T4连接酶连接。用PCR、酶切及测序鉴定。 22华支睾吸虫成虫CsSCCRO基因的表达和纯化 将pET-30a(+)一CsSCCRO重组质粒转化的大肠杆菌BL．21中表达，IPTG诱 导后超声裂解破碎，最后用Ni—NTAAgarose蛋白纯化柱纯化目的蛋白，核酸蛋 白定量分析仪DU530(Beckman)NU浓度。 2．3华支睾吸虫成虫CsSCCRO蛋白的Western—blotting鉴定 赵玉利硕士学位论文 赵玉利硕士学位论文 中文摘要 采用SDS—PAGE电泳和Western blotting方法，一抗分别用长期感染华支睾 吸虫的猫血清和轻度感染的大鼠血清(均为1：100稀释)，以GSTl为阳性对照 来检测CsSCCRO蛋白的免疫原性。 3华支睾吸虫CsSCCRO的细胞生物学功能初步研究 3．1 CsSCCRO蛋白刺激大鼠卵圆细胞的作用探讨 将卵圆细胞接种于96孔板，待细胞生长稳定后按一定浓度加入目的蛋白刺 激，以PBS为阴性对照进行MTT试验。在细胞生长的12 h、24 h、36 h、48 h、 60 b等五个时间点检测细胞492 nnl的吸光度，来反映细胞的生长变化；提取实 验组和对照组细胞的总mRNA，通过RT—PCR检测肿瘤转移相关基因c—myc和 CD44表达量的变化。 3．2将CsSCCRO基因转染入Hela细胞和大鼠肝卵圆细胞作用探讨 构建pEGFP．N1一CsSCCRO真核重组质粒，脂质体法转染pEGFP—N1一Cs SCCRO入Hela细胞和大鼠肝卵圆细胞，荧光倒置显微镜观察CsSCCRO的表达， 为进一步的功能研究打下基础。 研究结果 1华支睾吸虫CsSCCRO基因的编码序列结构分析 从华支睾吸虫成虫cDNA文库中发现与人鳞状上皮癌肿瘤相关基因相类似 的基因，暂命名为CsSCCRO：CsSCCRO是完整的全长基因，该基因全长1218 bp。 其ORF含碱基780 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，编码259个 氨基酸。其推导氨基酸序列与人鳞状上皮癌基因编码蛋白一致性达到50％，保守 功能域分析发现该序列含有螺旋一环一螺旋一亮氨酸拉链结构，与核转录因子类癌 基因相似；其编码氨基酸理论分子量为30500，理论PI值5．46。 2华支睾吸虫CsSCCRO基因克隆、表达和Western-blotting鉴定 用设计的引物PCR从cDNA文库中扩增CsSCCRO编码区cDNA序列，用 琼脂糖电泳鉴定在略大于750 bp处，测序确定为780 bp。定向克隆获得的重组 赵玉利硕士学位论文 赵玉利硕士学位论文 中文摘要 原核表达质粒pET-30a(+)一CsSCCRO经PCR、双酶切和／或测序证实构建成功。 重组质粒在IPTG终浓度1mmol／L，28。C下诱导表达可溶性重组融合蛋白，经 SDS—PAGE显示与目的蛋白分子量相符，重组蛋白经亲和层析纯化后得到纯化后 的目的蛋白。 Western blotting证实长期自然感染华支睾吸虫的猫血清能