水牛胎儿骨髓间说充质干细胞分离培养及基因转染的初步研究-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docxVIP

至4代后，其增殖速度随着代数的增加而下降；17cm以上胎牛来源的BMSCs 至4代后，其增殖速度随着代数的增加而下降；17cm以上胎牛来源的BMSCs 其增殖速率，第2代高于第1代细胞，第3代开始下降且低于第1代细胞。 (2)对所分离得到的水牛胎儿BMSCs进行生物学特性鉴定发现： RT-PCR检测到第3代细胞表达oct4、sox2、nanog等多能因子和CD73、 CD90、CDl05等细胞表面抗原。免疫荧光分析发现第3代细胞表达OCT4、 Nanog和CD73。流式细胞仪检测结果显示：第3代、第5代、第10代、 第15代和第20代细胞的CD29和CD44的阳性率均大于95％，造血干细胞 表面抗原CD45和内皮细胞表面抗原CD31的阳性率均小于2％。体外诱导 分化试验表明第3代细胞可以被定向诱导分化为成骨细胞和成脂细胞。 (3)在常氧培养条件下，水牛胎儿BMSCs随着培养代数的增加，CD29+ 阳性细胞比例逐渐下降；细胞内应力纤维合成受阻，细胞形态由梭形逐渐 转变成多边型；培养至10代后，间质细胞标记(mesenchymal marker)基因： snail、slug、历J、N-Cadhering mRNA的表达水平下降。然而，在低氧培养 条件下，免疫荧光染色结果显示：细胞内的低氧诱导因子1、2(mF．1、HIF．2) 的表达被激活，其下游基因twist的表达量亦随之升高，与此同时间质标记 基因snail、slug、伤，、N-Cadhering、colla的表达量亦随之升高；细胞黏附 试验表明，低氧条件下细胞的黏附性较于常氧条件下更小，更具有间质细 胞特性；细胞免疫荧光染色亦表明：在低氧条件下，水牛胎儿BMSCs的应 力纤维较在常氧下合成更稳定，表达量更高。培养于低氧条件下的P3、P10 和P20水牛胎)LBMSCs核型分析统计结果表明随着细胞代数的增加，核型正 常率下降，培养于低氧条件下的P10、P20细胞核型正常率高于常氧条件下 的 (4)在转染试剂相同的情况下，相同代数的水牛胎儿BMSCs转染效率 显著高于BFFs(15．6％士0．1713．3％--t：0．13，P0．05；23．9％士0．2119．1％士0．2 2，P0．05)；转染同一种细胞的情况下，转染试齐lJLipofectamineTM 3000的 II 万方数据 转染效率显著高于Roche⑧X．tremegene(19．1％士O．2213．3％4-0．13，P0．05；23．90／社0．2115．60／硅0．17，PO．05)。在此基础上利用Lipofect锄ineTM3000 转染效率显著高于Roche⑧X．tremegene(19．1％士O．2213．3％4-0．13，P0．05 ；23．90／社0．2115．60／硅0．17，PO．05)。在此基础上利用Lipofect锄ineTM3000 将带有催乳素(PRL)基因的质粒分别转染了相同代数的水牛胎儿BMSCs 矛IIBFFs，水牛胎儿BMSCs转染效率同样显著高于BFFs(18．5％土O．1916．4％ 士O．14，PO．05)；PCR检测结果显示转染的细胞有PRL基因整合。 结论：(1)从10---17cm长的水牛胎儿长骨分离的骨髓利用全骨髓贴壁 法可以分离得到具有间充质干细胞特性的BMSCs；(2)水牛胎儿BMSCs在 10％的血清浓度和低氧(5％02)条件下体外培养，细胞中HIF．Twist轴被激 活，其下游靶基因snail、slug、N-Cadherin、fnl幂Dcollal表达量升高，从而 有助于BMSCs维持其间质干细胞的特性和更稳定的核型；(3)在质粒和转 染试剂相同的情况下，水牛J]台)LBMSCs的转染效率显著高于BFFs。 关键词：水牛胎儿骨髓间充质干细胞低氧转染效率 III 万方数据 THE THE PRELIMINARY STUDY ON ISoLATIoN AND GENE MODIFICATION oF FETAL BUFFALo BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELL AB STRACT The fetal buffalo bone marrow mesenchymal stem cells(bBMSCs)were isolated from fetal buffalo bone marrow by adherent culture method．The biolgical characteristics were identified by morphology observation，the techniques of flow cytometry,immunofluorescence staining and R