动物细胞工程第二章 动物细胞培养.pptVIP

第二章 动物细胞培养 【成份和性状】 本品系用狂犬病病毒固定毒株（CTN-1V株）接种Vero细胞株，培养后，收获病毒液，经灭活病毒、浓缩、纯化，加入适量明胶、蔗糖保护剂冻干制成，为白色疏松体，重溶后为澄明液体，无异物，含硫柳汞防腐剂。 内容提要： 1.相关概念 2.体外培养细胞的生物学特性 3.影响细胞培养的理化因素 4.细胞培养的主要设备和仪器 5.细胞原代及传代培养方法 6.培养细胞的常规检测 7.无限细胞系的建立 8.动物细胞培养技术的应用 第一节、基本概念 1.动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 三个层次：细胞培养 组织培养 器官培养 （应用极少） 鸡胚胎成纤维细胞培养(10×40) 人牙周膜组织培养至第6天细胞自组织块边缘游出(10×10) 2.原代培养（primary culture）从体内取出组织或细胞接种培养到第一次传代的操作过程。 3.传代或传代培养（passage culture ）将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶的过程即称为传代或传代培养。 胰酶消化法细胞原代培养 传代培养 4.细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。 无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。 5.细胞株 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞称为细胞株。从培养代数来讲,可培养到40-50代以上。 人正常胎肝细胞系 Hela 细胞株（p94 图4-31） 6.细胞体外转化（in vitro transformation） 细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其他特性的可遗传的变化（P 96-98）。 转化的分子基础是DNA或基因的突变 ,一般可分为自发转化和诱发转化。 （1）自发转化 发生：当对细胞进行冻存或者反复传代时，在一些难以控制的因素影响下，即可发生自发转化，如血清质量下降、病毒污染、温度和pH值波动等。 表现：核型异倍化、获得永生性、接触抑制消失等，转化细胞形态上变得肥大 。 （2）诱发转化 途径： 化学诱变剂：MNNG、MMS、EUN等试剂 物理射线处理：X射线、电离辐射、Co60等 生物性因素：SV40、EBV等病毒处理 Ras、myc等原癌基因转染 端粒酶基因转入等 （3）细胞转化的检测 软琼脂培养法 浸润性检测法 异种动物接种检测法 7. 细胞一代时间 所谓细胞“一代”一词，指从细胞接种到分离再培养时经历的一段时间，它与细胞倍增一代非同一含义。 如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。 一般来讲，在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。 第二节、体外培养细胞的特征 （一） 体外培养细胞的类型 1. 贴附型： 这类细胞在培养时能贴附在支持物表面生长。大 多数培养细胞呈贴附型生长； 特点: 体内是立体贴附. 细胞—组织—器官. 体外为固相平面贴附, 细胞形状与体内不同. 分类: 判断细胞形态时不能按照体内组织学标推 判定，仅大致分成以下四型: （二）体外培养细胞的超微结构 细胞外被：糖蛋白膜，利于细胞贴壁。 细胞骨架：影响细胞的形态和运动。 细胞器：线粒体、高尔基体、高尔基体等。 细胞核：与体内正常细胞差不多。 （三）体外培养细胞的生长增殖特性 1.培养细胞的增殖态和功能态 （1）增殖态：指处于增殖状态的细胞，细胞本身胞体不断长大，并持续分裂。 （2）功能态（分化态）：指处于执行特定功能活动（如分泌、传导、吞噬、收缩等）状态的细胞。 （3）二者的比较：增殖态-----连续分裂细胞 功能态-----G0细胞或终末细胞 2.培养细胞的生命周期 1.细胞密度接种密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期越短 2.细胞类型传代细胞潜伏期比原代细胞短。单个细胞群快,细胞大团慢,组织块慢。连