基因工程菌培养若干重要问题的研究-生物化工专业论文.docxVIP

塑堑查堂堕主堂垡垒奎 塑堑查堂堕主堂垡垒奎 鱼 塑茎 摘要 本论文以基因工程菌培养生产人表皮生长因子和青霉素酰化酶为研究对象，针 对基因工程菌培养中具有共性的若干关键问题：质粒稳定性、代谢副产物的抑制作 用及高密度培养中的氧传递等，研究采用适当的工程措施，提高产物的表达水平。 主要的研究内容和成果包括： 一、 大孔树脂在hEGF重组菌培养过程中的原位吸附分离乙酸 乙酸是基因工程大肠杆菌培养过程中产生的主要代谢副产物之一，对菌体生长 和产物表达具有严重的抑制作用。论文首先考察了外加乙酸钠或乙酸对生产hEGF 的重组菌E．coli JMl01的生长和外源基因表达的影响，发现外加乙酸钠后，重组菌 的延滞期增长，并且随着乙酸钠浓度的增加，对重组菌的抑制作用越明显，乙酸钠 浓度达到309·L。时，就可几乎完全抑制重组菌的生长：而乙酸对外源基因hEGF的 表达研究表明，乙酸盐浓度高于209．L’1以上时，就可完全抑制产物表达。 根据乙酸的理化性质，筛选了对乙酸吸附量较大的阴、阳离子树脂各一种，研 究了阴、阳离子树脂的用量对重组菌生长的影响，结果表明在培养液中添加1．09／30ml 的阴、阳离子树脂对重组菌的生长无影响，而对外源基因的表达具有明显的促进作 用。 重组菌在培养过程中添加离子交换树脂后，可以将代谢产生的乙酸及时地原位 交换到树脂上，可明显地降低发酵液中乙酸含量，减轻乙酸对重组菌生长和hEGF 表达的抑制作用。经2．5L罐的重组菌发酵研究表明，加入离子交换树脂后，发酵周 期缩短了-J,时，目的产物hEGF的表达量提高到了225mg．L～。 二、 固定化基因工程菌在新型三相流化床生物反应器中培养生产hEGF 根据基因工程菌固定化后能提高质粒稳定性和细胞密度的特点，采用新型固定 化载体聚氨酯泡沫(PUF)，进行重组菌Ecoli JMl01的吸附固定化，这种固定化方 法具有可在反应器内就地进行、方法简单、成本低廉、传质阻力小等优点。摇瓶培 养研究结果表明，固定化可显著提高菌体密度和hEGF的表达量。自行设计了一套 适合该固定化细胞发酵的新型三相流化床生物反应器，通过对不同通气量、不同载 体量的研究表明，O．8L反应器装液量为500mL，载体用量5．og、通气量为3vvm的 条件下培养时，hEGF的表达水平最高。根据实验数据建立了考虑质粒稳定性的游离 培养和固定化培养基因工程菌间歇发酵生产hEGF的动力学模型，实验数据与模型 计算结果比较表明，该动力学模型可合理地解释和描述hEGF重组菌的培养过程。 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 ⑨ 摘要 采用二段连续培养表达系统提高了重组菌的质粒稳定性和目的基因的表达水平。 在第一段三相流化床中保持抗生素选择压力进行PUF固定化细胞培养使含质粒细胞 快速增殖，在第一段反应器中增殖得到的游离细胞进入第二段鼓泡塔反应器中，添 加IPTG诱导表达hEGF。研究了稀释率对重组菌两段连续培养过程的影响，发现在 第一段反应器内，游离菌体浓度随着D的增加而下降，质粒稳定性随着D的上升而 上升，基质葡萄糖浓度则随着D的上升而迅速增加；在第二段表达反应器中，目的 基因hEGF的表达量开始时随着D的上升而增加，当D0．2h。时，表达量则随着D 的上升而下降。在D=0．2h1稀释率条件下，重组菌可稳定连续培养达60h以上，hEGF 平均表达量为140mg．L～，连续培养60h后含质粒细胞百分数仍维持在约27％。 三、 重组菌B．subtilis巾105MU331发酵生产PGA的研究 重组菌B subtilis m105MU331属于PGA基因整合型并通过温度诱导表达的基因 工程菌。首先，优化了生长条件，包括氮源种类、碳源种类、培养温度及初始pH等， 对重组菌B．subtilis dpl05MU331生长及PGA表达的影响；其次，考察了诱导条件， 包括诱导温度、诱导阶段及时间等对PGA重组菌生长及PGA表达的影响。研究结 果表明，PGA重组菌在34℃培养、50℃水浴中热诱导4min的条件下PGA表达水平 最高。利用单因素实验和正交实验相结合的方法优化了培养基组成，其配方为：牛 肉膏359 L～，yeast extract 59·L～，淀粉129·L～，葡萄糖39·L～，NaCI 39·L一，NaC03 2．0 g．L-‘，NaHC03 1．59．L～，pH 6．5。在重组菌培养过程中，添加野生菌PGA表达的 诱导物苯乙酸却显示出对重组菌的生长及PGA的表达都有抑制作用。 在两段培养系统的基础上，设计了一套适合PGA重组菌的三段(细胞生长一升 高温度