多聚酶链式反应扩增片段.pptVIP

* * 1.DNA的基本单位－ ① ② ③ ④ ⑤ 脱氧核苷酸 （脱氧核糖核酸） 五碳糖 磷酸基团 羟基 3，端 5，端 A T G C A T G C 5，端（含磷酸基团） 3，端（含羟基） 3，端 5，端 2. 脱氧核苷酸链的形成 3.DNA分子的双螺旋结构 ⑴DNA分子是由 的脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。 ⑵ 与 交替连结，排列在外侧，构成基本骨架； 排列在链的内侧。 ⑶两条链上的碱基通过 连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与 配对， 一定同胞嘧啶配对。 双螺旋 两条反向平行 脱氧核糖 磷酸 碱基 氢键 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 4.复制过程 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 DNA聚合酶 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 催化合成DNA子链 DNA聚合酶的特性 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。 3’ 5’ 5’ 3’ 因此，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。 4.复制过程 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定。 一、基础知识 解旋酶（打开DNA双链） DNA母链（模板） 4种脱氧核苷酸（合成子链原料） DNA聚合酶（催化子链合成） 引物（ RNA）（使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸） 自主阅读P59，并思考： 体外扩增DNA，需要怎样环境？ 变性（ 80-100℃ ） Taq聚合酶（耐高温） 20—30个核苷酸构成DNA DNA母链 4种脱氧核苷酸 缓冲溶液，控制温度 1. DNA 分子的热变性原理 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃） 复性（缓慢冷却） 变性的目的： 复性的目的： 解开双链 有利于引物与两条单链结合 在80~100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 PCR技术总结 利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。 四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、引物、 DNA模板、缓冲溶液和控制温度的温控设备。 子链的5’端向 3’端延伸 具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性好、易自动化等突出。 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 3/ 引物Ⅰ 5/ 3/ 引物Ⅱ 变性95oC 复性55oC 延伸72oC 5/ 3/ 3/ 5/ 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 经n次循环（复制）后，DNA的含量理论上可以扩大到 倍。 2n 每次循环分为： PCR的反应过程总结 变性 ——复性——延伸 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸 PCR的反应结果 二、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。 能够自动调控温度的仪器 （二） PCR的操作步骤 （1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上离心约10s （离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应） 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C,10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min （一）理论上DNA扩增数目的计算 1 .一条DNA，复制n次， DNA为 。 2 . a条DNA，复制n次， DNA为 。 三、结果分析与评价 2 n a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线