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第八节 蛋白折叠 体外折叠研究： 如：变性和复性 体内折叠研究： 新生肽链折叠 一 蛋白折叠的机制及途径: 未折叠蛋白（U）快 折叠中间体 慢 成熟蛋白（N） （一） 蛋白折叠的起始：自由能降低过程，为自发性 二级结构的形成：首先形成一些忽隐忽现的二级结构。 证据来源于蛋白复性实验(二级结构 形成18ms，三级结构形成100~500s ) 疏水塌缩: 蛋白折叠起始缘于疏水力的作用和溶剂挤压效应 (hydrophobic collapse有可能先于二级结构) 特殊结构: 二硫键等(存在张力) （三） 蛋白质折叠的限速步骤： 蛋白质的天然构象一般是热力学上最稳定的构象 在热力学上最稳定的构象，不一定是动力学上容易达到的构象 限速步骤： ① 二硫键的形成 ② Pro的顺反异构化过程 （3）Stress-70(Hsp70): 在所有物种中高度保守；单体Mr=70,000 所有成员都有一定的ATP酶活性，帮助从靶蛋白上释放 功能： 识别未折叠或错误折叠的蛋白并以单体形式与其结合，在ATP存在下，帮助正确折叠 此外，细胞质中的Hsp70能与核糖体上正在合成的新生肽链结合，使多肽以完全伸展的状态进行跨膜运输。 Stress-70家族成员：Dna k， Dna J （E. coli）; Bip （动物细胞内质网腔）； Scs1P （酵母线粒体） （三）分子伴侣的功能 ① 稳定新生肽链未折叠构象，帮助新生肽链正确折叠 ② 帮助寡聚蛋白亚基的正确组装 ③ 维持蛋白处于可转运构像，辅助跨膜运输 ④ 参与抗逆反应 ⑤ 个别分子伴侣兼有折叠酶的作用： 如：E. coli分子伴侣 触发因子：脯氨酰异构化酶 Dna J：催化二硫键氧化、还原 及异构化 PDI结构： 为二聚体蛋白，每个单体有五个结构域 核磁共振法（NMR）测定的PDI结构域a和结构域b 2. 肽基脯氨酰顺反异构酶 (peptidyl prolyl cis-trans isomerase ,PPI): 分布：具有PPIase活性的蛋白质广泛分布于各种生物体及各 种组织中 定位：多数定位于细胞胞浆中，但也存在于其它细胞空间，如存在于E.coli的周质间隙、红色面包霉的线粒体基质、酵母与果蝇和哺乳动物细胞的内质网。 分类：依照与免疫抑制剂的结合情况 环孢霉素亲和蛋白（Cyclosporin）：环孢霉素A结合 FK结合蛋白（FKBP）：FK506及那巴霉素（rapamycin） 可与它们结合并抑制其催化活性。 在T细胞中：PPIase起抑制T淋巴细胞功能的生理作用。 基本作用： 是催化蛋白质折叠的起始过程及其Pro顺反异 构化的酶。 通过非共价键方式稳定扭曲的酰胺过渡态而催化肽酰基脯氨酰基（X-Pro）间的顺式与反式的相互转变。 例如，在碳酸酐酶的折叠中，PPIase一方面在其早期中间体的形成过程中起分子伴侣的作用（阻止不正确的凝聚），另一方面在折叠的较晚时期发挥以上催化活性 三 蛋白质折叠的研究方法及思路 （一）研究思路： 1. 小肽在水溶液中的构象及其转变： 天然小肽，蛋白质同源片段的溶液构象 2. 变性蛋白的复性： 将蛋白质变性，观察复性过程中蛋白质的折叠 3. 合成不同长度的新生肽片断： 在不同的阶段终止正在核糖体上合成的蛋白质肽链，从而得到一系列不同长度的肽片断（都是以N-端开头），然后观察他们的折叠过程。 （二）研究方法： 快速动力学方法与蛋白质空间结构研究方法相结合，捕捉 蛋白质折叠的中间状态，拼出折叠过程