- 1、本文档共67页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
临床样本的采集运输和保存及核豪酸提取
* * * * * * * * * * * * * * * * * * 表面活性剂加蛋白酶K,氯仿-酚抽提法: 每mg组织中加入1mlTrizol试剂,高速破碎组织(使用高速组织捣碎器) 加入氯仿0.2ml,轻轻颠倒混匀,室温静置分层。 高速离心12000rpm,4-8 °C ,10分钟 吸上清液至新离心管中,约600ul 加入500ul异丙醇,混匀,室温静置10分钟 高速离心12000rpm,4-8 °C ,10分钟 弃上清液,沉淀为RNA 加入1mlDEPC处理的75%乙醇,混匀,7500rpm离心, 4-8°C,5分钟 加入DEPC处理水30ul,混匀,55-60 °C水浴 3ul加入297ulDEPC水,测定浓度和纯度 异硫氰酸胍(GuSCN)结合氯仿-酚提取法 试剂的作用: 加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等还原剂可以还原RNase中的二硫键,有利于RNase的变性、水解与灭活 (四)、mRNA的分离纯化 除血红蛋白及组蛋白的mRNA外,绝大多数mRNA在其3′末端带有长短不同的poly(A)尾巴 利用碱基配对原则,通过oligo(dT)-纤维素或poly(U)-琼脂糖凝胶的亲和层析,可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * (一)、DNA样品准备 常见的标本: 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织: 最好新鲜组织,若不能马上提取,应贮存 - 70℃或液氮 DNA提取前样本采集、预处理和保存: 全血 抗凝剂: EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素 抗凝剂处理血 肝素 柠檬酸* EDTA* -80℃ 保存2个月,第10天收率90% 4 ℃ 第四天收率90% 第10天提取效果差 第十天收率85% 室温 提取效果差 第四天收率90% 第十天提取效果差 (二)、DNA提取 (一)酚抽提法: 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞,消化蛋白,然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA,最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100-150kb。 酚 抽 提 法 提 取 步 骤: DNA酚抽提法示意图 主要试剂的作用: EDTA:1. 二价金属螯合剂,抑制核酸酶; 2. 降低细胞膜的稳定性 SDS的作用: 1. 溶解膜蛋白和脂肪,从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体,使其解聚,将核酸 释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物,使蛋白质变性 蛋白酶K: 水解蛋白质的作用,消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比,它具有更强的水解能 力,而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性,可 同时使用 苯酚: 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂,微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和,防止吸收过多DNA,降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA DNA的沉淀: 1)无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子,作用是中和核酸分子表面的负电荷,有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水,使DNA沉淀析出,无水乙醇使用前冰冻,可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。 2)异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外,还可以溶解少量的小的RNA分子 (二) 甲酰胺解聚法: 破碎细胞同上,然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物,可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。 (三)磁珠法: 磁珠在高盐低pH值下吸附核酸,在低盐高pH值下与核酸分离,再通过移动磁珠来获取DNA (四)微柱法 : 利用DNA在高盐、低pH的特定溶液环境下可吸附在固相介质(如硅胶膜)上,洗涤去除杂质后,再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中 (三)、DNA的浓缩 固体聚乙二醇(PEG)浓缩:用透析袋 外敷PEG至合适量 丁醇抽提浓缩:DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇,但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积 (四)、DNA回收 主要是从电泳中分离回收DNA片段 回收原则:尽量提高回收率 去除回收DNA样品中的污染物 DNA降解的原因 样本不够新鲜,采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因? 提取的基因组DNA盐浓度过高 基
您可能关注的文档
- 老社区获得性随肺炎的诊治原则.ppt
- 老人用药护理.ppt
- 老神经系版统特点.ppt
- 老神経疾患志的康复.ppt
- 乐拓商业和计划书.ppt
- 乐拓商业计司划书2.ppt
- 雷达气象我学1-1.ppt
- 乐理与视唱2.ppt
- 雷达气象刘学2-4.ppt
- 雷达气象淡学4-2.ppt
- 电子行业光刻机深度筚路蓝缕寻光刻星火-23090861页.pdf
- 阿斯麦-美股公司投资价值分析报告全球光刻机龙头受益于先进制程需求增长-23061536页.pdf
- 华懋科技-公司研究报告-安全气囊龙头企业光刻胶业务曙光已现-23040919页.pdf
- 帕克街Parklu中国护肤品牌KOL网红营销分析报告英文版15页.pdf
- 华懋科技-持续加码新材料领域安全气囊光刻胶齐头并进-22121032页.pdf
- 宝立食品-定制西调引领者方便速食加速放量-22072439页.pdf
- IZEA2024澳大利亚网红信任度报告英文版25页.pdf
- 网经社2023年618中国电子商务用户体验与投诉数据报告36页.pdf
- 波士顿咨询BCG2022年合成生物技术前景展望报告英文版27页.pdf
- 未来今日研究所FTI2022年合成生物学生物技术和农业技术趋势报告英文版55页.pdf
文档评论(0)