聚合酶链式反应原理..ppt

聚合酶链式反应技术Polymerase Chain Reaction 常立功 2014-09-29 -学术活动- PCR的起源与发展 PCR基本原理 普通PCR过程与分析 荧光定量PCR过程与分析 -学术活动- PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。 DNA在复制时，其中两条以氢键结合的互补链必须先行分开，才能各自作为复制的模板；而打开双螺旋的最简单方法就是加热。在高温下，双股DNA链会分离成单股，等温度降低后，互补的两条DNA链又可以恢复成双股。虽然DNA分子能耐高温，但进行DNA复制所需的聚合酶是蛋白质，在高温下会失去活性。这也是之前的研究人员不认为这种方法可行的原因之一。再有，要在千万条DNA当中，以一小段已知序列制成的引物，“钓”出所需的片段，进行复制，也跟大海捞针差不多，这是另一个让人却步的理由。 -学术活动- 1953年，DNA被发现是细胞里携带遗传信息的分子。 1956年，第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶（此时的基因扩增仅在实验室，小规模的扩增，操作繁复，成本高）。 1973年，台湾人钱嘉韵在黄石公园里热泉中发现的嗜热菌中并分离出耐热的Taq聚合酶。 1984年，美国人K. Mullis (穆里斯 )和日本人才木共同奠定了现代PCR技术的基础，使PCR技术进入普通实验室，前者在1993年获得诺贝尔化学奖 -学术活动- 现代实验室大多使用RT-PCR技术检测某个基因的表达。 逆转录（Reverse?Transcription RT）是将RNA转录成cDNA的过程。 为什么要进行逆转录？ 为什么要提取RNA而非DNA？ -学术活动- -学术活动- -学术活动- 1.Oligo(dT)18 ： 能与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，适合真核生物mRNA的转录,尤其是新鲜的组织或细胞，当所提取的RNA片段长度小于2kb,无复杂三级结构 随机六聚体引物：适用于mRNA内含抑制反转录酶活性的终止序列，适合提取无Poly(A)尾巴的RNA、石蜡和破碎组织内提取的RNA，特别是当提取片段超过2kb，内部有复杂的三级结构的， 特异性引物：用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 -学术活动- -学术活动- -学术活动- -学术活动- 荧光染料法原理 退 火 -学术活动- 标准曲线分析法 -学术活动- 标准曲线分析法 -学术活动- 无需制备标准品(2 -ΔΔc(t) 法)，但需要内参照基因，且要求内参与目的基因扩增效率相近。 内参Ct值=15-14=1，21=2； 基因A: delta CT=20-18=2，22=4。 但是由于加样量是2倍，所以4/2=2，最后的相对 量是2倍 最常用的荧光染料是SYBR Green，它能与DNA双链的小沟进行结合，这种结合时非特异性的， * 逆转录示意图 逆转录体系 逆转录引物区别 普通PCR反应体系 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq 酶 Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应组分 变 性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 普通 PCR示意图 延 伸 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ 重 复 退 火 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 循环2 X2个拷贝 循环3 X3个拷贝 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ PCR反应模式 普通PCR结果分析 荧光定量PCR 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq酶 Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应组分 变 性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ SYBR Green I Taq ID l ID 延 伸 5’ 3’ 5’ 3’ 5’