生物信息学表达谱帽流程简介.ppt

* * * 表达谱流程简介 科学特种兵团RNA线 韩祖晶 hanzujing@ 数字基因表达谱（Digital Gene Expression Profile，DGEP） DGE DGEII  DGE 1、DGE实验流程和实验原理： 如右图，展示的是DGE 的实验流程。从总的RNA 样品到mRNA的提取再到 cDNA的合成再到Tag的 制备最后到上机测序和数据产出。 DGE如右图，展示的是DGE的实验原理。利用OligodT的beads富集总RNA中mRNA，并逆转录为双链cDNA，采用4碱基识别酶NlaIII酶切双链cDNA，链接Illumina adapter1，利用MmeI酶切3’端CATG下游17bp碱基，并在3’端链接Illumina adapter2。再加入Primer GX1和Primer GX2进行PCR扩增。扩增后样本通过6% TBE PAGE胶回收85碱基条带，纯化后通过Illumina基因表达测序。 DGE2、DGE信息分析流程：  DGE2.1、去除杂质数据 原始序列带有一段3’adaptor序列，并且含有少量低质量序列以及各种杂质成分。经过一系列数据处理，得到Clean Tag。 数据处理的步骤： 去除3’adaptor序列：原始read带有一段3’adaptor序列， 首先要去除每个read的3’adaptor序列； 去除空载reads（只含3’adaptor而不含Tag序列的reads）； 去除低质量Tag（含有未知碱基N的tag）； 去除长度过小过大的Tag，保留长度为21nt的Tag； 获得Clean Tag。 2.2、Clean Tag 拷贝数分布统计不均一性是细胞mRNA表达的显著特征，少量种类mRNA表达丰度极高，而大部分种类mRNA表达水平很低甚至极低。Clean Tags数据中，Tags的拷贝数反映了相应基因的表达量，其分布统计可以从整体上评估数据是否正常。 DGE  DGE2.3、测序饱和度分析饱和度分析检验随着测序量（标签数量，Total Tag Number）的增加，检测到的基因是否随之上升。 2.4、实验重复性分析 对两次平行实验的结果相关性分析可获得对实验结果可靠性和操作稳定性的评估。 DGE  DGE2.5、基因表达注释 首先，我们根据合作伙伴提供的参考基因数据库（注：对于没有参考基因数据库的物种，可以在同属种中进行同源比对，但结果仅供参考。），利用软件检索mRNA上所有的 CATG位点，生成CATG＋17nt碱基的参考标签数据库。然后将全部Clean Tag与参考标签数据库比对，允许最多一个碱基错配，对其中唯一比对到一个基因的标签（Unambiguous Tags）进行基因注释，统计每个基因对应的原始Clean Tag数，然后对原始Clean Tag数做标准化处理，获得标准化的基因表达量，从而更准确、科学地衡量基因的表达水平。标准化方法为：每个基因包含的原始Clean Tags数 / 该样本中总clean Tags数 * 1,000,000 (t Hoen, Ariyurek et al. 2008; Morrissy, Morin et al. 2009）。   DGE Clean Tag 和参考基因、线粒体、叶绿体和参考基