实验碱性磷酸酶米氏常数生的测定.ppt

实验五 碱性磷酸酶米氏常数的测定 一、目的要求 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。 二、原理 一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1．原理 2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。 1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸 （3）比较吸光度的比值 纯DNA （二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 2．常用方法 （1）标准曲线法 OD或Ａ 　　　　　　　　　　　　　　　　　浓度 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 （2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/?（?为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。 (三)米氏常数的测定原理 酶促反应v-[S]曲线 v [S] 推导出米氏方程为： 其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数 米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/[S]作图，可得一条直线 1/v 1/Vm -1/Km 1/[S] 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm. 反应式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。 三、试剂与器材 试剂： 0.5?mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠—碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、6 mg/mL碱性磷酸酶酶液 器材：恒温水浴锅、722分光光度计 四、分光光度计的使用 1．722型分光光度计的外形 2.仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长 3.样品测试操作 ① 打开电源开关，使仪器预热20分钟 ② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 ③ 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 ④ 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零 ⑤ 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 ⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A) ⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 ⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 ⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A ⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数 实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。 五、操作方法 （一）对硝基苯酚标准曲线的制作 取5支试管编号