人原发性肝癌细胞系的建立及肝癌相关分子基础的研究-遗传学专业论文.pdf.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 肿瘤的发生过程中，各种环境与遗传因素以协同或序贯的方式引起DNA突 变，该突变积累被认为与原癌基因的激活与抑癌基因的失活有关，同时凋亡调 节基因与DNA修复基因的改变，从而引起表达水平的异常，使靶细胞发生转化。 被转化的细胞首先呈克隆性的增生，经过一个漫长的多阶段的演进过程，其中 一个克隆相对无限制的增殖，通过附加突变，选择性的形成具有不同特点的亚 克隆，从而获得浸润和转移的能力，形成恶性肿瘤。这一系列复杂的过程涉及 到细胞、染色体，基因表达及表观遗传学等各种水平上生物学特征改变，对这 些发生变化的特征研究，将对癌症的预防、早期检测、等级评估及预后都有着 重要意义，也将为临床探索肿瘤治疗方法提供理论支持。本研究的主要目的是 从细胞生物学、表观遗传学和的分子生物学角度，对肝细胞癌进行研究与分析， 探讨肝细胞癌的起源及发展过程中发生的特征改变及相应分子机制。主要结果 如下： 1．通过对29例临床肝癌手术组织中的肝癌细胞进行分离与鉴定，通过组织 破碎方法建立了一株来源于低分化原发性肝癌的细胞系(TJ3ZX，01)，并对该细胞 系的细胞周期、生长曲线，染色体数目等细胞的生物学特征进行鉴定，结果显 示为癌细胞特征，免疫细胞化学染色结果表明与肝癌细胞系SMMC．7721细胞相 比，该细胞系具有上皮细胞的特征，但不具有明显的成熟肝细胞特征，肝细胞 标记物表达较低；利用流式细胞仪分析不同的细胞表面标记物在细胞中的表达 情况，其阳性细胞的比例在传代过程中保持稳定的水平，认为其中少量的肝癌 细胞可能具有干细胞与前体细胞的性质，暗示此例低分化原发性肝癌的来源为 肝干细胞或前体细胞，进一步丰富并验证了肝癌的细胞起源理论。 2．利用甲基化特异性PCR(MSP)技术，选择8个与癌症发生相关基因作为甲 基化水平的研究对象对四种不同类型的肝癌细胞系进行研究，观察基因在不同 肝癌细胞系中的甲基化状态，基因的选择同时考虑不同的细胞信号通路和在肝 癌与其它消化道肿瘤中的特异性。RIZl、DA鹏GSTP珀勺甲基化研究结果在这 四种细胞系中是一致的，暗示不同细胞在发生癌变的过程中具有某种程度上的 共同特征。而HepG2的甲基化状态与其它三种细胞系相比差异较大，这可能与 摘要HepG2细胞本身为肝母细胞瘤，其细胞学特征与肝细胞癌存在着差异有关，这种 摘要 HepG2细胞本身为肝母细胞瘤，其细胞学特征与肝细胞癌存在着差异有关，这种 差异在分化程度不同的肝细胞癌之间也存在，SMMC．7721和BEL．7404与 TJ3ZX．01细胞之间的甲基化状态可能由于细胞起源的不同而存在着差异性， BEL-7404与TJ3ZX-01细胞之间的一致性也表明了在分化程度与细胞来源相近的 肝癌细胞中，其基因表达通路的调节往往会显示出相似的地方。本研究进一步 提示了在肝癌发病过程中可能由于其细胞来源的不同，导致其在基因表达调控 中也存在着相同的或不同的调节机制。在不同细胞通路上的关键基因的甲基化 状态在不同类型细胞之间的差异，也为肝癌起源的研究提供佐证。但肝癌细胞 起源对此后的肝癌发展到底会有多大的影响，仍然需要进行深入的研究。 3．利用GeneChip Human Mapping 500K SNP芯片技术检测了原发性肝癌细 胞系TJ3ZX．01与SMMC．7721全基因组拷贝数变异(city)情况，结果显示肝癌细 胞中存在着大量的CNV位点，根据SNP实验数据结果筛选得到了四个平均拷贝数 大于7且扩增片长度大于400 kb的候选区域，对此区域采用荧光定量PCR技术， 利用序列标签位点(STS)弓I物在4l例原发性肝癌患者组织与细胞系TJ3ZX．01中 进行拷贝数验证，首次发现与正常人外周血DNA相比，其中的三个候选区域在 超过50％的肝癌组织中呈现拷贝数增加的趋势，分别是位于lq21．爿l-_chrl：149 123 015．149 549 088扩增区域，长度为426 074 bp，在56．1％(23／41)肝癌组织中显示 扩增；位于lq22—23．1上chrl：154 094 408．155 143 699扩增区域，长度为1 049 292 bp，在80．5％(33／41)肝癌组织中显示扩增；位于7p22．1上chr7：4 509 826．6 796 428 扩增区域，长度为2 286 603 bp，在75．6％(3 1／41)的肝癌组织中显示扩增，暗示 该高频扩增与肝癌发生与发展之间存在着某种联系。 4．利用荧光定量PCR技术，对位于1q22—23．1上的高频扩增区域(80．5％)进行 研究，检测在此区域上存在的候选基因在4l例已知拷贝数的肝癌患者组织与对 应的癌旁非肿瘤组织以及肝癌细胞系中的表达情况，序列分析显示共有15个基 因位于lq22-23．1扩增位点内