人羰基还原酶CBR1抑制剂的筛选及EGCG增效蒽环类药抗肿瘤活性机制研究-遗传学专业论文.pdf.docxVIP

复旦大学博士学位论文人羰基还原酶CBRl抑制剂的筛选及EGCG增效蒽环类药物抗肿瘤活性机制研究中文摘要 复旦大学博士学位论文人羰基还原酶CBRl抑制剂的筛选及EGCG增效蒽环类药物抗肿瘤活性机制研究 中文摘要 葸环类药物是最有效的抗肿瘤的药物之一，但是由于肿瘤细胞对此类药物的 天然或获得性的耐受性以及药物对正常组织的毒性，尤其是心脏毒性，使得蒽环 类药物在临床应用上受到限制。目前已经发现人的羰基还原酶(carbonyl reductse 1，CBRl，Genbank No．J04056)，可以还原代谢葸环类抗肿瘤药物，如柔 红霉素(DNR)，阿霉素(DOX)，生成相应的醇代谢物，即柔红霉素醇和阿霉素醇。 代谢产物与药物原型比较，抗肿瘤效果显著减弱，还会导致心脏毒性。同时，细 胞内的CBRI的含量还会因为蒽环药物的作用而上调表达。CBRI对药物的还原代 谢的导致肿瘤细胞对药物耐受并增强了药物的毒副作用。针对以上情况，以CBRl 为靶，寻找开发它的抑制剂，与葸环类抗癌药物的联用既可增强药物的抗肿瘤效 果，逆转肿瘤细胞耐药性，还可降低化疗时的毒副作用。我们希望通过我们的工 作，找到新的，抑制效果好并具有临床应用前景的CBRl抑制剂。 根据已知的CBRl抑制剂的结构特征，我们通过搜索小分子结构数据库 (ACD、CNPD、MDDR)共收集到约180种类黄酮结构类似物，并应用AUTODOCK4程 序，从中筛查新的CBRI抑制剂。分子对接结果显示，表没食子儿茶素没食子酸 酯(EGcG)与CBRI有很好的结合亲和性，很有可能成为新的CBRl抑制剂。而且， EGCG是茶叶中的天然活性成分，具有防癌抗癌，抗氧化等效应，临床上具有广 阔的应用前景。因此，为了研究EGCG能否作为抗癌药物增效剂使用，因此我们 重点选择EGCG研究其抑制CBRI的分子机制和对柔红霉素抗肿瘤活性的影响。 为了检测EGCG对CBRl活性抑制的分子机制，我们原核表达并纯化了重组 CBRl蛋白。用大分子互作仪确认了EGCG和CBRl的直接结合，亲和常数为 KD(M)=2．73e。6。建立体外酶活测试体系检测EGCG对CBRl的抑制动力学特征，包 括检测EGCG抑制CBRl的还原活性的IC50为0。58 It M；EGCG和辅酶NADPH，EC圮G 和底物Isatin之间均为非竞争性抑制关系；EGcG结构中的没食子酸酯基为抑制 CBRl实现的关键部位；EGCG抑制具有pH依赖性，pH的变化引起EGCG的质子化 状态的改变，在中性和弱碱性条件(生理pH条件)EGCG去质子化，表现出更强 的对CBRl的抑制活性。 为了解析EGCG和CBRI的结合模式，我们对EGCG-CBRl的结合进行分子模拟， 点突变CBRI关键氨基酸残基进行验证。结果显示，EGCG的多酚羟基和CBRI活 性中心氨基酸通过形成多氢键保证二者的结合。EGCG的没食子酸酯基上的羟基 占据了CBRl的催化中心，阻碍了结合底物的进一步催化。EGCG和CBRI结合区 域外围的碱性氨基酸Lys95和Ar9231通过正电荷对去质子化EGCG的吸引，提高 复旦大学博士学位论文人羰基还原酶CBRl抑制剂的筛选及EGCG增效蒽环类药物抗肿瘤活性机制研究EGCG在活性中心浓度，从而保证EGCG对CBRl高效抑制。 复旦大学博士学位论文人羰基还原酶CBRl抑制剂的筛选及EGCG增效蒽环类药物抗肿瘤活性机制研究 EGCG在活性中心浓度，从而保证EGCG对CBRl高效抑制。 为了在细胞水平检测EGCG对柔红霉素抗肿瘤活性的增效。用自制CBRl的多 克隆抗体筛查肝癌细胞内源CBRl的表达量，在高表达CBRl的肝癌细胞株HepG2 和SMMC7721进行EC,CG和柔红霉素的联用，EGCG不仅能增强柔红霉素对肝癌细 胞增殖的抑制作用，还能增强药物对细胞G2／M期阻滞的效果。 为了证明EGCG对柔红霉素的增效作用是CBRl介导的，通过上调或RNAi下 调细胞中CBRl的表达量后再进行药物联用。用低表达的Hep3B细胞株，建立超 量表达CBRl的稳定细胞株，EGCG可以逆转外源CBRl导致的细胞对DNR的耐药 性。对于高表达CBRl的HepG2，我们用特异RNAi来下调内源CBRl的表达量， HepG2细胞对柔红霉素敏感且EGCG对柔红霉素的增效作用也不显著了。 为了进一步验证EGCG可以抑制细胞对柔红霉素的代谢，我们使用HPLC来分 离和测定细胞裂解液中的柔红霉素代谢物一一柔红霉素醇的含量，随着细胞裂解 液中EGCG的浓度升高，柔红霉素醇的含量梯度降低，说明EGCG通过有效地降低 柔红霉素的代谢对药物作用增效。 为了在整体动物水平检测EGCG和柔红霉素联用的效果，建立检测化合物体内 作用的人SMMC7721裸鼠移植瘤模型。EGCG对柔红霉素抑