丹参赤霉素合成与代谢相关基因家族的鉴定、分子克隆及表达分析-生药学专业论文.pdf.docxVIP

中国医学科学院药用植物研究所 中国医学科学院药用植物研究所 2012级博士研究生杜清 丹参赤霉素合成与代谢相关基因家族的鉴定、分子克隆及表达分析 学号：B2012009006 摘 要 lUllIIIIIIIlUlUlIIIlllIIIIIIlllIIIII]111 Y3075726 赤霉素为一种重要的植物生长激素，属于四环二萜类化合物，是萜类化合物生 物合成途径的下游产物。赤霉素生物合成过程中，一般先通过质体中MEP(2．C． 甲基．D．赤藓糖醇-4．磷酸)途径合成中间产物GGPP(栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸)， 再在一系列酶的催化下，形成不同种类的赤霉素。细胞质和线粒体中合成GGPP的 MVA(甲羟戊酸)途径在赤霉素生物合成过程中也有一定作用。本论文从丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)全基因组数据库中鉴定了内根．贝壳杉烯氧化酶(SmKO)、贝壳 杉烯酸氧化酶(SmKAO)、赤霉素20．氧化酶(SmGA200x)、赤霉素3．氧化酶 (SmGA30x)和赤霉素2．氧化酶(SmGA20x)等参与赤霉素合成与代谢相关的基因， 基于PCR技术对鉴定得到的基因进行了分子克隆，对cDNA和蛋白质的序列特性 以及亚细胞定位进行了分析，构建了系统进化树，研究了它们在丹参根、茎、叶和 花等多组织中的表达，分析了古巴焦磷酸合成酶(SmCPS)、内根．贝壳杉烯合成酶 (SmKSL)、 内根．贝壳杉烯氧化酶(SmKO)、 贝壳杉烯酸氧化酶(SmKA例、赤霉 素20．氧化酶(SmGA200x)、赤霉素3．氧化酶(SmGA30x)和赤霉素2．氧化酶 (SmGA20x)等基因对外源赤霉素GA3处理的响应情况。另外，对丹参赤霉素生物 合成途径上游基因IDI(删_『徊∞凹)进行了克隆及转基因的初步分析。结果如下： (1)基于丹参全基因组序列，通过同源比对，鉴定了1个SmKO、2个SmKAO、 6个SmGA200x、2个SmGA30x和1 1个SmGA20x基因；采用PCR技术埘所有鉴定 出来的新基因进行了克隆，获得全部22个基因的开放读码框序列(ORF)。 (2)基于生物信息学分析了cDNA和推断的氨基酸序列的特征，结果表明22 个基因的ORF长度在933．1557bp之间，理论等电点在5．38．9．43之间，推测的蛋白 质长度在311和51 9氨基酸残基之间，偏酸、碱性氨基酸都有，分子晕为 34．36-57．73KDa。基于TargetP预测了22个蛋白质的Ⅱ细胞定位，发现SmKO、 SmKA01和SmKA02氨基酸序列的氮端含有分泌途径的信号肽，-口JI能定位于内质网； SmGA200x4、SmGA20xl和SmGA20x5氨基酸序列的氮端含有叶绿体转运肽，可能 定位jj：质体；其它蛋白质不含信号肽和转运肽，可能定位。J二细胞质。 (3)分别构建了植物KO、KAO、GA200x、GA30x和GA20x等蛋白的系统 进化树，发现SmKO．与胡麻科的芝麻(Sesamum indicum)和玄参科的黄色猴而花 (Erythranthe guttata)亲缘关系较近；SmKAOI和SmKA02在系统进化树上聚在 一块，说明SmKA01和SmKA02为种内同源基因；植物GA200x蛋白’口J分为4个进 万方数据 中国医学科学院药用植物研究所 中国医学科学院药用植物研究所 2012级博士研究生杜清 丹参赤霉素合成与代谢相关基因家族的鉴定、分子克隆及表达分析 学号：B2012009006 化分枝，6个SmGA200x分别位于其中的2个分枝；植物GA30x蛋白可分为3个 进化分枝，SmGA30xl和SmGA30x2分别在不同的分枝，可能来源于不同的祖先； 植物GA20x蛋白可分为4个进化分枝，11个SmGA20x分别位于其中的3个分枝。 (4)实时定量PCR技术分析了22个基因在丹参根、茎、叶和花组织中的表达， 发现赤霉素合成与代谢途径基因的表达具有显著的组织特异性。SmKO基因在花中 表达最高，茎和叶其次，根中最低；SmKA01和SmKA02在所有组织中都有表达， SmKA01在根、茎、叶中的表达较花中高，而SmKA02在根、花和叶中的表达较高， 茎中较低；与此类似，SmGA200x、SmGA30x和SmGA20x基因的表达也有组织特异 性。 (5)外源GA3处理丹参12、24和48小时后，绝大多数赤霉素生物合成与代 谢相关的基因在根、茎和叶中的表达水平发生显著改变。部分基因在根、茎和叶中 显著上调，如SmCPSl、SmCPS3、SmCPS5、SmKSLJ『、SmKSL2、SmGA20x4、SmGA20x5、 SmGA20x6和SmGA20x7；部分基因的表达显著下调，如SmGA200x2、SmGA30xl、 SmGA20xl、SmGA