全反式维甲酸诱导N--乙酰氨基葡萄糖基转移酶V表达受阻的肝癌细胞通过内质网应激途径发生调亡的研究-生物化学与分子生物学专业论文.pdf.docxVIP

博士学位论文全反式维甲酸诱导N．乙酰氨基葡萄糖基转移酶V表达受阻 博士学位论文 全反式维甲酸诱导N．乙酰氨基葡萄糖基转移酶V表达受阻 的肝癌细胞通过内质网应激途径发生凋亡的研究 摘 要 N．乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V，GnT-V) 是分布在高尔基体中的一种重要的N．糖链加工酶，它以UDP．GlcNAc为供体， 催化七糖二天线阶段或八糖三天线阶段的N一糖链形成三天线及四天线N．糖链。 GIlT_V与肿瘤的发生和转移相关，其产物GlcNAcfll，6Mantel，6结构与多种癌细 胞的转移潜力有关。本室研究发现，GnT-V表达受阻增加了人肝癌SMMC7721 细胞对全反式维甲酸(a11．trans-retinoic acid，ATRA)诱导的凋亡的敏感性，但 机制尚不明确。此外，我们还发现内质网应激发生于CJnT-V表达受阻的 SMMC7721细胞。在本论文中，我们进一步探讨了ATRA诱导GnT-V表达受阻 的SMMC7721细胞发生凋亡的机制，并将其与内质网应激联系起来。 在前期的研究中我们发现GnT-V反义eDNA稳定转染的SMMC7721细胞 (GnT-v-AS／7721)中存在持续的慢性的内质网应激。从本论文的第一部结果我 们得出结论：ATRA通过加剧Gn■V-AS／7721细胞中的内质网应激诱导细胞凋亡。 在80州ATRA处理24小时的GnT-V-AS／7721细胞中，我们发现内质网应激标 志性分子GRP78／Bip(glucose regulated protein 78／immunoglobulin chain binding protein)、CHOP(C／EBP homologus protein)及剪接后XBPl(X box binding protein 1)的表达上调，这些结果都说明ATRA加剧了本来存在于GnT-V诅s／7721细胞 中的内质网应激。此外，ATRA处理的GnT-V-AS／7721细胞中还发现了caspase．12、 ．9和．3的剪切激活以及凋亡形态学变化，说明ATRA诱导了细胞凋亡。以上的 所有结果表明，ATRA通过加剧GnT-V-AS／7721细胞中的内质网应激诱导细胞凋 亡。这为我们提供了一个ATRA诱导肝癌细胞发生凋亡的新机制。进一步的研 究结果发现，80州ATRA显著抑制GnT-V-AS／7721细胞中GnT-V的表达，这 可能是ATRA加剧GnT-V-AS／7721细胞中内质网应激的机制之一。 在论文的第二部分，我们在80¨M ATRA处理的GnT-V-AS／7721细胞中检测 到GRP78／Bip、CHOP、剪切后ATF6(activating transcription factor 6)蛋白及 XBPl mRNA剪接产物的上调，caspase一3、PARP[Poly(ADP-ribose)polymerase]也 发生了剪切，这再次证明ATRA加剧了GnT-V-AS／7721细胞中的内质网应激并 诱导细胞凋亡的结论。更重要的是，我们发现ATRA抑制了GnT-V-AS／7721细 胞中同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代谢酶CBS(cystathionine-p—synthase) 和BHMT(betaine—homocysteine methyltransferase)的表达，增加了细胞内Hey 博士学位论文浓度，并降低了细胞内GSH(glutathione)水平。为了观察ATRA对细胞Hcy 博士学位论文 浓度，并降低了细胞内GSH(glutathione)水平。为了观察ATRA对细胞Hcy 代谢的作用，我们用不同浓度的外源性Hey处理细胞。结果发现，ATRA处理使 GnT-V-AS／7721细胞中的Hcy浓度快速提升到一个很高的水平，这说明ATRA 干扰了GnT-V-AS／7721细胞的Hey代谢，造成了细胞内Hcy堆积，因而增加了 GnT-V-AS／7721细胞对外源性Hcy诱导的内质网应激的敏感性。同时，我们也观 察到了CRP78／Bip的显著上调和XBPl mRNA的完全剪接。进一步的研究发现， 在GnT-V-AS／7721细胞中，ATRA降低细胞内GSH浓度，并阻碍了外源性Hcy 诱导的GSH水平的提高。所有的结果表明，ATRA通过抑制Hey代谢关键酶CBS 和BHMT的表达提高细胞内Hcy水平、降低细胞内GSH浓度，从而加剧了 GnT-V-AS／7721细胞中的内质网应激并诱导细胞凋亡。值得一提的是，来源于正 常肝组织的L02细胞对ATRA诱导的凋亡不敏感，ATRA对其Hcy代谢的作用 也不明显。也就是说，ATRA仅特异性地诱导G-nT-V表达抑制的GnT-V-AS／7721