基因重组与直基因工程.ppt

第十四章基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第一节 自然界中的DNA重组和基因转移 DNA重组 同源重组：最基本的重组方式，发生在同源序列间 的重组。 特异位点重组：广泛存在，由整合酶催化在两个 DNA序列的特异位点间发生的整合。 转座重组：基因从一个位置转移到另一个位置，由可 移动的DNA介导。 基因转移 接合作用：细菌通过菌毛相互接触时，质粒可从一个 细胞转移至另一个细胞 转化作用：通过自动或人为的供给外源DNA，使细胞 或培养的受体细胞获得新的遗传表型 转导作用：当病毒从被感染的细胞（供体）释放出 来，再次感染另一细胞（受体）时，发生 在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及 基因重组 第二节 重组DNA技术 --DNA克隆，分子克隆 一、重组DNA技术相关概念 （一）DNA克隆（也称基因克隆或重组DNA） 克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化：获取同一拷贝的过程，也称无性繁殖。 DNA克隆：应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子—复制子，再通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提取获得大量同一DNA分子的过程，也称基因克隆、重组DNA。 限制性核酸内切酶 T4DNA 连接酶 DNA聚合酶I （Klenow片段） 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 限制性核酸内切酶 （ Restriction Endonuclease，RE ）：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 来源: 超过3000种，绝大多数限制性内切酶来自于细菌 作用： 与甲基化酶共同组成细菌的限制修饰系统，限制 外源DNA，保护自身DNA。 分类： 根据酶的组成，所需因子，裂解DNA方式不同分为I、II、III 型，基因重组过程中常用II型 　Ⅰ类　　　识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。　　 Ⅱ类　　 识别切割特异性强，切割发生在识别位点。　　 Ⅲ类　　 切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。 T4DNA连接酶 噬菌体T4DNA连接酶 酶的催化过程需要ATP辅助，16℃ T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。 不能催化两条游离的DNA链相连接 （三）目的基因（又称外源DNA） 基因组DNA： 在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。 cDNA： 经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。。 （四）基因载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA 粘粒(柯斯质粒）、细菌/酵母人工染色体 克隆载体(cloning vector)： 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)： 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的 载体。 在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等）。 噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。 由于噬菌体结构简单、基因数少，是分子生物学与基因工程的良好实验系统。 用作克隆载体的噬菌体有2种：λ噬菌体， M13噬菌体。 野生型，48.5kb，双链线性，两端12个碱基的单链粘性末端。基因组三个区域：左侧区（成熟），中间区（非必须），右侧区（调控）。 迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其