米氏常音数测定方法.docVIP

酶活米氏常数实验 一、实验前准备 1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。 2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。 3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200μL和10μL移液枪、50μL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸 4、记录本上提前写好实验的加样顺序： 催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200μL缓冲液 ②10μL催化剂 ③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10μL) ④32μLH2O2（排枪加） 催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200μL缓冲液 ②10μL催化剂 ③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64μL） ④10μL底物TMB（ABTS）（排枪加） 数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。 Code 1 2 3 4 5 6 7 Time TMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10 V01 Code 1 2 3 4 5 6 7 Time H2O2 2 4 6 8 10 16 32 64 V01 二、实验 1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。电脑开机，密码为mby-nano，双击酶标仪软件图标，出现登录框，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面，若底物为TMB，选择“铁动力学”(波长为650nm) ，选择模板1 ； 打开电脑内置时钟， 若底物为ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为405nm） 。 新建一个word文档，以日期命名，打开。 2、加样：96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。以TMB为例，从第1列加样： ①从A1至H1，每孔加200μL NaAc/HAc Buf； ②从A1至H1，每孔加10μL催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）； ③从A1至H1，每孔分别加不同体积（0，0.5，1，2，4，6，8，10μL）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）； ④用排枪吸取32μL H2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：00：00） Code 1 2 3 4 5 6 7 Time 00：00 00：30 01：00 01：30 02：00 02：30 03：00 03：30 TMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10 V01 用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。每次读板出来结果后，点击“结果入库”——“是”——“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。 HYPERLINK \l 直接拷数据的方法 (现已可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法) 3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。 4、若当天不再继续实验，将24孔板中剩余的H2O2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。 三、数据处理 1、打开Origin6.1，点击右上角的“Add New Column”（箭头所指）： ，亦可右击—— Add New Column 。 2、输入数据：命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。X列时间从0-180s，0 s对应微孔板编号1的数据，30 s对应code2的数据，以此类推，将所读数据输入。 点击“file”—“Save Project As”， 保存文件名为“第一组”。 3、数据输入完成后，选择X和Y列，点