用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸.pptx

项目四 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸;目录;L-酪氨酸;制备或来源：1.由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中提取； 2.以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得； 3.以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用β-酪氨酸酶催化制取。 用途：1.医药用作甲状腺功能亢进； 2.食品添加剂。 3.是一种重要的生化试剂，是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料。 4.广泛用于农业科学研究，也作饮料添加剂和配制人工昆虫饲料。; L-酪氨酸对皮肤的作用皮肤白不白，主要取决于黑色素细胞合成黑色素的能力。在人的表皮基层细胞间，分布着黑色素细胞，它含有的酪氨酶可以将酪氨酸氧化成多糖，中间再经过一系列的代谢过程，最后便可生成黑色素。黑色素生成得多，皮肤就越黑；反之，则皮肤就越白皙。 研究证明，酪氨酸酶的活性与体内的铜、铁、锌等元素密切相关。经常进食富含酪氨酸和稀有元素锌、铜、铁的物质，例如动物内脏、肾，甲壳类动物蛤、蟹、河螺、牡蛎，水产品乌鱼子，豆类的大豆、扁豆、青豆、赤豆，硬壳果类花生、核桃、黑芝麻以及葡萄干等，皮肤的色泽就较黑。因此住在海边的人，打渔的渔民，由于吃以上水产品较多，因此皮肤色泽较黑。 ;L-酪氨酸的酶法合成;酪氨酸酚裂解酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体重，其中酶活较高的微生物主要是草生欧文氏菌、中间柠檬酸菌、弗氏柠檬酸以及嗜热菌和Symbi-obacterium toebii等。近年来，来源于上述微生物的TPL，其空间结构和作用机制已得到较深入研究，并在工业化应用方面取得重要进展。 ;弗氏柠檬酸菌的培养及破碎;特征特性：革兰阴性杆菌，有周鞭毛，能运动，无芽胞，无荚膜。具有氨苄青霉素（Ampr）、卡那霉素（Kanr）、四环素（Tcr）及链霉素（Strr）抗性。光滑、低凸、温润、半透明或不透明，表面有光泽，边缘不整齐。菌体杆状，直径1.0，长2—6μm。菌落直径2—4mm。出芽繁殖为主，酒类增香。用于白酒增香。可以含有10ppm MG的无机盐培养基中正常生长，最适生长温度为30℃。 ;实验材料： 菌株：弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii) 试剂： LB培养基： 配方：酵母提取物 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼脂 15~20g 、水 1000mL（调节pH 7.4~7.6）;1.菌种培养： 配制培养基 菌种活化 待灭菌后的固体培养基冷却至50℃时，倒入平板中（大约每平板15mL），待平板凝固后，挑取菌种进行划线接种。接种好的平板倒置于培养箱中，37℃培养24h。 扩大培养：挑取上面培养好的菌落，放入已灭菌好的液体培养基的三角瓶中进行扩大培养。37℃、200r/min摇床过夜培养。（培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多） ;2.破碎细胞 菌体收集：取已经培养过夜的弗氏柠檬酸菌菌悬液于离心管中，3000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。 细胞破碎：向离心后的沉淀中加入Tris-HCL（PBS）缓冲液（1:20），在漩涡混合器混合。然后再超声破碎仪下破碎，功率和时间根据菌液多少确定。功率不得太高，不要起气泡。循环次数不要太多，运行2s，间歇6s。冰上破碎效果更佳，菌液破碎前为乳白色，破碎后为透明。 收集破碎液：将破碎好的液体倒入离心管中离心，3000r/min离心5min。弃沉淀，上清液备用。;酪氨酸酚裂解酶的活力测定： 福林酚试剂时磷铂酸与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。;用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸 L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸具有重要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。;Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的C.intermiedius固定化细胞作为催化剂，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸钠、45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯化铵和55mmol/L苯酚的转化体系，反应5h后可积累L-酪氨酸10g/L。若将反应体系置于连续的柱反应器内，苯酚对L-酪氨酸的转化率达90%，且稳定性可维持5d。;酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定;实训器材及试剂： 层析缸、毛细管：5只/组、培养皿：1只/组、层析滤纸（长16cm、宽16cm的）：1张/组、直尺、铅笔、电吹风、针、白线、小试管：4只/组、移液管、喷雾器。 ;1.展层剂和平衡液： 正丁醇：冰醋酸：水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层做展层剂；下层液（弃去）。 2.样品液： 用水配