PCR技术在食品安全检测中的应用.doc

PCR技术在食品安全检测中的应用 姓名 宁 馨 学号 2009132137 专业 生物技术 班级 093 班 二〇一一年十二月 PCR技术在食品安全检测中的应用 姓 名：宁 馨 指导老师：武晓英 （太原师范学院 生物系093班 学号 2009132137） [摘要]: 食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品营养、安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题，近年来,已经引起了人们的高度重视.有关食品安全检测的技术也因此受到重视,其中 PcR技术以其灵敏度高、特异性强以及快速准确等优势在食品检测领域得到愈来愈广泛的应用. 本文主要介绍了PCK技术检测食品微生物的优点，分析了PCR．技术在食品检测中的应用及一些新的PCR检测技术，并进一步说明了这些技术在食品微生物检测中的发展和应用。 [关键词]: 多聚酶链式反应 PCR 食品检测 食品安全 微生物 1．PCR技术的原理 聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)，又称无细胞克隆技术(FreeBacteria Cloning Technique)，是一种根椐生物体内DNA复制的某些特点而设计的，在体外对特定DNA序列进行快速扩增的技术。自美国Cetus公司人类遗传室KaryMullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术及其相关技术就以惊人的速度发展起来，在多种核酸检测技术中都得到了广泛的运用。PCR反应体系主要由寡核苷酸(引物)、4种dNTP、TaqDNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成，它改变了传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，而是将扩增建立在三步重复发生反应的基础上：①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA；②退火延伸引物至特异性寡核苷酸上；③ 酶促延伸引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。(图1)溶液中核苷酸通过聚合酶的作用形成互补的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA，成为下次PCR复制的模板。因而每次循环特异性DNA片断将以双倍量增加，典型扩增经过20-40次循环能引起100万倍的扩增，大大提高了DNA的得率。因此，当知道待检病原具有某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR扩增，增加靶DNA数量，使其达到足够的检测量(图2),通过电泳检测扩增出的特定片断，即可确定感染的病原。[1] 2．PCR技术的发展 2.1 常规PcR检测 对细菌进行分类鉴定的常规PCR技术，主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的，如核糖体RNA(rDNA)、gyrB基因、toxR基因等。自6O年代末，Woese首次运用rDNA分析生物的系统发育以来，rDNA数据库快速扩大，已成为细菌多样性、系统进化与发育研究广泛采用的序列。细菌的16SrDNA基因核苷酸序列具有高度保守性，它的序列变化与进化距离相适应，被称为一种进化分子钟。由于其进化速度大约是每五千万年发生1％的碱基变化，所以适用于种以上水平的鉴定。研究细菌16SrDNA最直接的方式就是通过基因测序并与Genbank、EMBL、DDB等国际通用的数据库比对，根据同源性的大小确定细菌种的归类。23SrDNA基因也是非常保守的序列，由于它与16SrDNA基因是线性串联排列，在此基础上就发展出利用16S-23SrDNA基因间区序列来对细菌进行鉴定的方法。这个基因区段的进化速度高于16S rDNA，因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。除此以外，还有其它一些高度保守的序列，如gyrB基因(细菌中广泛存在的一种编码DNA的拓扑异构酶Ⅱ的B亚基的单拷贝基因)、toxR基因(弧菌中的毒素表达调控蛋白基因)等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。 2.2 多重PCR技术 多重PCR技术是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，其检测原理与传统PCR相同.如果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入1对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩增出l条以上的目的DNA片段。使用这一方法可以同时检测1个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。，可同时检测多种病原微生物。该技术自1988年Chamberlain首次应用于杜氏营养不良症(Duchenne musculardystrophy)基因外显子缺失的检测以来，已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用。[2] 2.3 免疫一PCR 免疫PCR是Sano等在1992年首创，其关键在于用一个连接分子将一段特和DNA分子之间建立相对