根癌农杆菌C58六型分泌系统关键组分ClpV结构和功能的初步研究-植物分子遗传专业论文.docxVIP

海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的 成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。均已在文中以明确方式标明。本声明的法律 结果由本人承担。 论文作者签名：茂应丽 日期： 矽11年歹月7日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。本人在导师指导．F完成的论文成果，知识产权归属海南大学和中国热带 农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文储签名．躅也丽 导师签名： 日期：≯，，年莎月7日 日期： w11年占月7日 本人已经认真阅读“CALLS高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 “CALLS高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。回童诠塞埕 作 签 F 赢名：柏 沦日 文期 剖加W 轹年 弧朋I 辰日 日期： uq年e月 摘 摘 要 细菌VI型分泌系统(Type VI Secretion System，T6SS)是近年发现的一种分 布广泛且与细菌致病性密切相关的新型分泌系统。除了介导与宿主细胞的相互作 用外，目前还发现VI型分泌系统还能介导细菌．细菌相互作用，并且细菌适应外 界环境方面发挥着重要的作用。因此，深入研究T6SS分泌机制，不仅对于动植 物病原细菌的治病机制研究和诊断方法的建立有重要的意义，同时由于T6SS所 具有的独特的杀菌作用，在细菌耐药性已成为一个严峻现实的今天，对于发现新 型抑菌策略，以及筛选新型抗菌药物均有潜在的巨大应用价值。 因此，对于知 之甚少的vI型分泌系统的研究已成为病原细菌领域一个新的研究热点。 因此，我们对模式植物病原菌根癌农杆菌C58的VI型分泌系统进行了研究。 通过生物信息学分析发现， ClpV型ATPase是不同细菌T6SS中均含有的关键 保守组分，据推测可能为底物蛋白的分泌提供动力，但对其生化功能尚未进行深 入鉴定。在本研究中，对ClpV型ATPase的结构和功能做了初步研究，其实验 结果如下： l：检澳llClpV型ATPase的ATPase活性并对其活性位点的分析： 克隆根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens C58中的CIpV型ATPase基因 atu4344并在大肠杆菌中表达，酶学检测证实了其ATPase活性，其最适pH为6．5， Vmax=42．8nmol min。1mg1，Kin=0．68mM，’以及当Ac．离子浓度越高时，其活性越 。．低。定点突变分析发现K232脚8和E299／675均丧失ATPase活性，表明Walker A motif 和Walker B motif与其活性密切相关。 2：ClpV型ATPase蛋白结构的检测分析： 利用非变性电泳分析发现CIpV型ATP黜呈现一个多聚体状态，进一步用凝胶 过滤和电镜分析发现Atu4344与T3SS中提供能量的InvC ATP蹴一样，呈现一个 环状的六聚体结构。 3：CIpV型ATPase聚合和解聚实验的检测分析： 用pull．down方法进一步研究发现该CIpV型ATP黜可与Atu4341和Atu4342形 成的复合体相互作用，但与Atu4341或者Atu4342单独均不能相互作用，在ATP 存在时Atu4344还可解聚Atu4341．Atu4342复合体。 存在时Atu4344还可解聚Atu4341．Atu4342复合体。 4：CIpV型ATPase功能的初步检测分析： 研究发现，与野生型菌株相比，突变体C勿哪点突变C勿y‘K232脚幻和ClpV ‘隧眺75’菌株，其分泌蛋白Hcp分泌至胞外的蛋白量几乎为零，而在回复突变株 中，Hcp蛋白的分泌得到一定程度的回复。 5：通过酵母双杂交实验，检测农杆菌C58的T6SS中23个蛋白互作，勾画蛋白 互作网络图。 关键词根癌农杆菌，咖y基因，酶学活性，突变分析，结构分析，功能检测 H AbstractType Abstract Type VI secretion system(T6SS)is a new discovered secretion sys